问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB和fliR突变株的构建及其功能的初步研究

论文摘要

钩端螺旋体（以下简称钩体）病是世界范围内流行的人兽共患的自然疫源性疾病。尽管不少学者一直致力于钩体致病机制的研究并取得一定的进展,但人们对钩体致病机制仍所知甚少。在许多细菌中,Ⅲ型分泌系统产物参与了对宿主细胞的粘附、侵入,诱导宿主细胞损伤。某些鞭毛相关蛋白也是Ⅲ型分泌系统家族成员。因此研究钩体鞭毛相关基因的功能可能有助于阐明其在粘附与侵入宿主细胞过程中的致病机制。本实验克隆了问号钩体56601株鞭毛相关基因flhA、flhB和fliR,构建其原核表达系统。针对基因flhA、flhB和fliR分别设计两对siRNA,电穿孔法导入钩体内,半定量RT-PCR技术检测钩体flhA、flhB和fliR基因mRNA的表达水平。构建插入失活型基因打靶载体,将其导入钩体内,构建flhA、flhB和fliR基因突变株。Fontana镀银染色法观察钩体56601标准株及flhA、flhB突变株粘附J774A.1细胞的能力。流式细胞术法检测钩体56601标准株及flhA、flhB突变株诱导J774A.1细胞坏死和凋亡的情况。结果表明:构建的原核表达系统在IPTG诱导下,能够表达目的重组蛋白rFlhA、rFlhB和rFliR。导入siRNA后,在荧光显微镜下观察到钩体内出现绿色荧光物质。半定量RT-PCR结果显示,flhA的两对特异性siRNA均能抑制其mRNA的表达;fliR的一对siRNA对其mRNA产生抑制。导入自杀质粒pUC18KA和pUC18KB的钩体能在含有卡那霉素的平板上生长。问号钩体56601标准株和flhA、flhB突变株均可粘附J774A.1细胞,但突变株的粘附率较低。在J774A.1细胞中,flhA突变株引起细胞坏死和凋亡的比率较标准株和flhB突变株低。推测极有可能钩体鞭毛相关基因flhA和flhB的产物参与了对宿主细胞的粘附、侵入、分泌毒性蛋白,从而诱导宿主细胞损伤。这些实验为进一步研究问号钩体鞭毛相关基因产物的致病功能奠定了基础。

论文目录

• 提要
• 英文缩略词表
• 前言
• 第一部分 文献回顾
• 1 细菌Ⅲ型分泌系统与细菌侵袭力
• 2 钩端螺旋体的致病机制
• 第二部分 实验研究
• 实验一 问号钩端螺旋体鞭毛相关基因FLHA、FLHB 和FLIR 的克隆及原核表达系统的构建
• 实验二 SIRNA 特异性抑制问号钩端螺旋体FLHA、FLHB 和FLIR 基因MRNA 表达的研究
• 实验三 应用基因打靶技术构建问号钩端螺旋体FLHA、FLH和FLIR 基因突变株
• 实验四 问号钩端螺旋体FLHA 和FLHB 基因突变株粘附和诱导J774A.1 细胞凋亡的研究
• 结论
• 参考文献
• 附录 主要试剂配制法
• 攻读博士期间发表的学术论文
• 摘 要
• ABSTRACT
• 致 谢