枯草芽胞杆菌B6-1产脂肽和聚-γ-谷氨酸及抗几种植物病原菌的研究

论文摘要

本文首次从作物根际土壤中分离、筛选出对几种作物病原菌具有稳定拮抗作用并产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌B6-1,对菌种进行鉴定,确定其拮抗谱,分离、纯化并鉴定抗菌物质,用红薯渣和豆渣作为固态发酵的主要基质,获得同时高产拮抗物质和聚-γ-谷氨酸,并对该固态发酵产物的生防和肥料增效作用进行了评价。结果如下:1.运用先富集再加热的方法,从作物根际土壤中分离得到313株芽胞杆菌。平板共培养筛选到37株对至少一种指示病原真菌表现出稳定的拮抗效果。其中菌株B6-1表现拮抗谱最广、拮抗能力最强。根据其生理生化特征和16S rDNA序列分析,被确定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。2.菌株B6-1产抗真菌活性物质。其发酵液具有油取代、液滴坍塌、红细胞溶血、水溶液中分子之间发生凝聚等典型的表面活性剂特性。所产拮抗物质能被酸沉淀,并能抵抗一定的高温、较宽的pH范围和紫外等条件。以上特性说明枯草芽胞杆菌菌株B6-1所产的拮抗物质应该属于脂肽类抗生素。3.采用超滤、酸沉淀、固相萃取相结合的方法来分离纯化菌株B6-1所产的抗生素。经过高效液相色谱（HPLC）分部收集并检测各峰拮抗活性,再经过LC-MS分析,主要活性物质的分子量分别为1450、1464、1478、1506,它们之间分子量差异为14的整数倍,即（CH2）n。部分分子量与已经报道的C15、C16、C17、C19脂肽类表面活性剂抗生素fengycins相吻合,但其拮抗谱不同,而且fengycins不具备溶血活性,所以可能还存在其它具溶血活性的脂肽。该fengycins具体的结构还有待进一步工作确定。4.在NB液体培养基发酵中,B6-1产生脂肽抗生素却不产γ-PGA,而在经过优化的高产γ-PGA的液体培养基中,γ-PGA的产量达到34.7 g/L,却不能检测到脂肽抗生素。采用红薯渣、豆渣作主要基质的固态发酵,γ-PGA的产量达到36.3g/（kg干物质）。同时脂肽抗生素的相对产量达到70个单位,而NB液体发酵中为20个单位。同时证实γ-PGA无抗菌活性。5.当施用B6-1采用红薯渣、豆渣作主要基质的固态发酵产物后,黄瓜枯萎病发病率降低至17%。在全营养水平下,添加B6-1的高产γ-PGA的固态发酵产物时,地下、地上部分干重和根冠比分别为0.447 g、2.448 g、0.183,而对照组分别为0.334 g、2.183g、0.153,地下、地上部分干重和根冠比各自分别比对照增加33.8%、12.2%、18.3%。在1/2营养水平下,添加B6-1的高产γ-PGA的固态发酵产物时,地下、地上部分干重和根冠比分别为0.339 g、1.405 g、0.242,而对照组分别为0.230 g、1.111 g、0.201,地下、地上部分干重和根冠比各自分别比对照增加47.4%、26.4%、20.4%。在1/3营养水平下,添加B6-1的高产γ-PGA的固态发酵产物时,地下、地上部分干重和根冠比分别为0.344 g、0.956 g、0.351,而对照组分别为0.203 g、0.814 g、0.251。结果说明,在各肥料水平下,根部、地上部干重和根冠比都较对照增加,随着肥料水平的下降,根部、地上部干重和根冠比较对照的增加幅度提高,特别是在低肥料浓度下,对根冠比的影响尤为明显。这一方面说明B6-1固态发酵产物中的γ-PGA可以促进作物的生长,另一方面由于在肥料较缺乏的时候,γ-PGA的增产效果尤为明显,也说明B6-1固态发酵产物中的γ-PGA具有肥料增效剂的作用,特别是更加有利于作物根对营养的吸收。6.在低温下γ-PGA具有提高菌体存活率的作用,特别是随着冻藏时间的延长,保护作用越显著。γ-PGA添加浓度以1.5%为适宜。经过冷冻干燥和冻藏一定时期后,添加γ-PGA的乳酸菌产酸活力下降较少,且基本没有迟滞期,都能在更短时间内产酸。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1 芽胞杆菌生防的机制
• 1.1 竞争作用
• 1.2 诱导植物抗病性
• 1.3 拮抗作用
• 1.3.1 非核糖体途径合成的肽类
• 1.3.2 其它抗生素
• 1.3.3 核糖体合成的多肽和蛋白质
• 2 脂肽抗生素
• 2.1 脂肽抗生素的结构
• 2.2 脂肽抗生素的合成机制
• 2.3 芽胞杆菌所产脂肽的生理功能
• 3 聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）的研究进展
• 3.1 聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）的结构与理化性质
• 3.1.1 聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）的结构
• 3.1.2 聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）的性质
• 3.2 聚-γ-谷氨酸的应用
• 3.2.1 农业上缓释剂、保水剂、肥料增效剂
• 3.2.2 在医药方面的应用
• 3.2.3 在环保领域的应用
• 3.2.4 在食品和化妆品领域的应用
• 3.3 聚-γ-谷氨酸的合成机理
• 3.4 γ-PGA发酵影响因素的研究
• 3.4.1 添加L-谷氨酸的影响
• 3.4.2 碳源的影晌
• 3.4.3 氮源的影晌
• 3.4.4 金属离子的影晌
• 3.4.5 pH和供氧对γ-PGA发酵生产的影响
• 3.5 提取工艺的研究
• 4 本课题的立题背景及研究目的
• 第二章 芽胞杆菌的分离和拮抗作物病原菌的芽胞杆菌的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 供试病原菌
• 2.2.2 菌株的培养和保藏
• 2.2.3 仪器
• 2.2.4 土样和植株的采集
• 2.2.5 两种方法的比较
• 2.2.5.1 直接分离法
• 2.2.5.2 富集分离法
• 2.2.6 拮抗芽胞杆菌的筛选
• 2.2.7 产拮抗物质的确定
• 2.2.8 拮抗芽胞杆菌的鉴定
• 2.2.8.1 菌种:
• 2.2.8.2 形态特征和生理生化鉴定
• 2.2.8.3 常用微生物培养基试剂
• 2.2.8.4 常用分子生物学试剂
• 2.2.8.5 引物
• 2.2.8.6 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 芽胞杆菌的分离
• 2.3.2 拮抗芽胞杆菌的筛选
• 2.3.3 形态特征和生理生化鉴定
• 2.3.4 16S rDNA PCR扩增产物
• 2.3.5 16S rDNA序列测定结果:
• 2.3.6 绘制系统发育树:
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 拮抗物质几种性质的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 有机溶剂溶解性
• 3.2.2 稳定性
• 3.2.2.1 热
• 3.2.2.2 pH
• 3.2.2.3 紫外线
• 3.2.3 酸沉淀
• 3.2.4 表面活性剂特性
• 3.2.4.1 溶血活性
• 3.2.4.2 排油
• 3.2.4.3 液滴坍塌
• 3.2.4.4 凝聚特性
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 稳定性
• 3.3.2 酸沉淀
• 3.3.3 有机溶剂溶解性
• 3.3.4 表面活性剂特性
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第四章 拮抗物质的分离纯化和鉴定研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 仪器与试剂
• 4.2.4 拮抗物质的产生
• 4.2.5 拮抗物质的分离纯化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 沉淀分离纯化法
• 4.3.2 多重超滤法
• 4.3.3 固相萃取法
• 4.3.4 酸沉淀、超滤、固相萃取结合分离纯化并鉴定
• 4.4 结论
• 第五章 液态发酵产脂肽和聚-γ-谷氨酸的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 培养基
• 5.2.2.1 产脂肽抗生素培养基
• 5.2.2.2 高产聚-γ-谷氨酸（PGA）的培养基
• 5.2.3 主要仪器
• 5.3 方法
• 5.3.1 种子培养
• 5.3.2 产脂肽抗生素的发酵培养
• 5.3.3 脂肽抗生素及相关参数检测
• 5.3.4 产γ-PGA的发酵培养
• 5.3.5 γ-PGA及相关参数检测
• 5.3.6 PGA的抗菌性
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 NB液体发酵各参数的变化
• 5.4.2 PGA高产液体发酵过程中各参数的变化
• 5.4.3 PGA的抗菌性的排除
• 5.5 结论
• 第六章 以红薯渣、豆渣为固态发酵主要基质产脂肽和聚-G-谷氨酸的研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 菌株
• 6.2.2 固态发酵基质
• 6.2.3 种子培养
• 6.2.4 固态发酵
• 6.2.5 脂肽抗生素、PGA、活菌数及pH值的检测
• 6.3 结果与分析
• 6.4 讨论
• 6.5 结论
• 第七章 拮抗芽胞杆菌B6-1对玉米小斑病生物防治的研究
• 7.1 前言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 供试拮抗菌株
• 7.2.2 供试病原菌
• 7.2.3 供试植株
• 7.2.4 接种用病原菌孢子液的制备
• 7.2.5 发酵液、菌体和无菌滤液对玉米小斑病的生防作用
• 7.2.6 发酵液和无菌滤液对病原菌孢子萌发的影响
• 7.2.7 拮抗芽胞杆菌不同接种时期的生防效果
• 7.2.8 拮抗芽胞杆菌施用后在叶面的定殖
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 发酵液、菌悬液和无菌滤液对玉米小斑病的生防效果
• 7.3.2 发酵液和无菌滤液对病原菌孢子萌发的影响
• 7.3.3 拮抗芽胞杆菌不同接种时期的生防效果
• 7.3.4 拮抗芽胞杆菌施用后在叶面的定殖
• 7.4 讨论
• 7.5 结论
• 第八章 固态发酵产物对黄瓜枯萎病生防和幼苗肥料增效作用的研究
• 8.1 前言
• 8.2 材料和方法
• 8.2.1 病原菌
• 8.2.2 病原菌孢子悬液的制备
• 8.2.3 供试植株
• 8.2.4 固态发酵产物对黄瓜枯萎病的生防效果
• 8.2.5 在黄瓜根际的B6-1活菌体数量变化
• 8.2.6 固态发酵产物对黄瓜幼苗的肥料增效作用
• 8.3 结果与分析
• 8.3.1 固态发酵产物对黄瓜枯萎病的生防效果
• 8.3.2 B6-1在黄瓜根际的活菌体数量变化
• 8.3.3 固态发酵产物对黄瓜幼苗的肥料增效作用
• 8.4 讨论
• 8.5 结论
• 第九章 聚-γ-谷氨酸提高乳酸菌抗冻性的研究
• 9.1 前言
• 9.2 材料和方法
• 9.2.1 菌株
• 9.2.2 乳酸菌的培养基
• 9.2.3 高产PGA的培养基
• 9.2.4 PGA的发酵
• 9.2.5 PGA的分离、提取
• 9.2.6 冷冻乳酸菌液的制备
• 9.2.7 菌体存活率的测定
• 9.2.8 菌体产酸曲线的测定
• 9.3 结果与分析
• 9.3.1 添加PGA对冷冻条件下乳酸菌存活率的影响
• 9.3.2 添加剂对冷冻条件下乳酸菌产酸能力的影响
• 9.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 博士在读期间（待）发表论文