J亚群禽白血病病毒gp37基因siRNA表达载体的构建及体外干扰效应的初步研究

论文摘要

本研究以禽白血病病毒J亚群（ALV-J）gp37基因为靶向基因,以RNA干扰的方法,干扰其表达,以达到限制ALV-J在细胞内复制的目的。参照Takara和Ambion公司的成功的经验并利用Ambion公司的在线设计工具httpp:www.ambion.com/techlib/misc/siRNA design html,针对ALV-J NX0101株gp37基因序列（编码跨膜蛋白TM）寻找siRNA靶序列,根据siRNA阴性对照设计原则设计相应的阴性对照。经BLAST验证,所选择的靶序列与鸡体和其它病毒基因片段无同源性。在设计的靶序列5’端开始的19个核苷酸为正义链,中间加入9个核苷酸TTCAA GAGA间隔以形成发夹结构,3’端加有转录终止信号TTTTTT。并且5’端带有BamH I（GATCC）酶切位点,3’端带有Xho I （ CTCGAG）和Hind III（TTCGA）酶切位点。靶序列分别被克隆到psilencer2.1-U6载体上。经Xho I酶切鉴定和测序鉴定后,证明已成功地构建了针对gp37基因不同区域的siRNA（small interfering RNA）表达载体。分别命名为pu6gp 37-1,pu6gp37-2,pu6gp37-3, pu6 gp37-4,pu6gp37-5,pu6gp37-6, pu6gp（阴性对照）。以提取的ALV-J NX0101株病毒基因组DNA为模板,根据Gene Bank上发表的ALV-J NX0101株gp37基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增出gp37 （591bp）基因,克隆到pMD18-T Vector。目的片段经双酶切连接到pEGFP-N1载体上,经酶切和测序鉴定后,证明已成功地构建了gp37基因的融合表达载体,命名为pEGFP-gp37。用pEGFP- gp37融合表达载体转染CEF细胞,分别在转染后24h, 48h,72h观察荧光的变化。发现转染后24h就可见到荧光,48h荧光最强,72h荧光逐渐减弱,减少;pEGFP- gp37与构建的针对gp37基因不同区域的siRNA表达载体分别两两共转染CEF细胞后,分别在24h, 48h,72h观察荧光的变化,结果发现,共转染48h后与pu6gp37-2、pu6gp37-4质粒共转染的孔荧光均减弱,荧光细胞数减少,初步验证pu6gp37-2、pu6gp37-4对TM蛋白有抑制作用。本研究为RNAi技术应用于抗ALV-J感染研究奠定了基础并为抗病毒研究提供了新途径。

论文目录

• 英文缩略表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 J 亚群禽白血病及其研状
• 1 J亚群禽白血病
• 2 ALV-J 的分子病毒学特性
• 3 ALV-J 的致病性及其免疫抑制作用
• 3.1 ALV-J 的致病性
• 3.2 ALV-J 的致瘤机制
• 3.3 ALV-J的免疫抑制作用
• 4. ALV-J流行病学
• 4.1 ALV-J 的宿主范围
• 4.2 ALV-J 的传播方式
• 5. J亚群禽白血病的病理变化
• 5.1 临床症状
• 5.2 组织学变化
• 6 诊断
• 6.1 ALV-J 的分离与鉴定
• 6.2 ALV-J 的PCR 检测
• 6.3 ALV-J 的ELISA 检测
• 7. ALV-J 的防制
• 第二章 RNA 干扰的研究进展
• 1 RNAi 的发现及发展
• 2. RNAi 的作用机制
• 3. RNAi 技术路线及应用
• 3.1 siRNA 设计
• 3.2 siRNA 的制备
• 3.3 siRNA 表达载体体外输送
• 4 RNAi 在动物病毒性疾病中的研究
• 4.1 RNA 干扰流感病毒的研究
• 4.2 RNA 干扰马立克氏病毒的研究
• 4.3 RNA干扰口蹄疫病毒的研究
• 5 RNAi 技术的展望与未来
• 第二部分 研究内容
• 第一章 siRNA 表达载体的构建
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 工具酶和主要试剂
• 1.3 引物合成
• 1.4 主要仪器
• 2. 方法
• 2.1 RNA 靶位点的选择
• 2.2 siRNA 设计
• 2.3 插入片段的准备
• 2.4 载体片段的准备
• 2.5 连接和转化
• 2.6 阳性克隆的筛选和鉴定
• 3. 结果
• 3.1 siRNA 的设计
• 3.2 siRNA 表达载体构建
• 3.3 重组质粒的序列测定
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二章 pEGFP-gp37 融合表达载体的构建
• 摘要
• 1. 材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 工具酶和试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 病毒和细胞
• 2 方法
• 2.1 pEGFP-gp37 重组质粒载体的构建及表达
• 2.2 重组质粒载体的鉴定
• 3 结果
• 3.1 间接免疫荧光检测
• 3.2 gp37 基因的扩增
• 3.3 pMD-gp37 质粒酶切鉴定结果
• 3.4 序列的测定及同源性比较
• 3.5 重组质粒载体pEGFP-gp37 的酶切鉴定
• 3.6 重组质粒载体pEGFP-gp37 的测序鉴定
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 siRNA 体外干扰gp37 基因的初步研究
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 细胞
• 2 方法
• 2.1 重组质粒pEGFP- gp37 在细胞上的表达
• 3 结果
• 3.1 pEGFP- gp37 融合表达载体转染 CEF 细胞
• 3.2 pEGFP- gp37 和不同的siRNA 表达载体共转染CEF 细胞
• 4 讨论
• 5. 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文