食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建

论文摘要

基因工程酵母菌在食品工业中的应用逐渐普遍,但重组菌抗生素抗性标记的存在对食品安全具有潜在隐患。此外,较低的生产成本、简单方便的下游操作技术和高水平的表达量等是工业大规模生产重组蛋白必须具备的特点。针对这些问题,本课题根据半乳糖-葡萄糖对GAL基因家族诱导-抑制效应以及GAL4p对GAL基因的调控机制,采用同源重组技术分步敲除了工业多倍体酿酒酵母MS-1染色体上的GAL1基因,并将GAL4基因整合到GALl基因位点,构建了不同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115.DPG65和GQ21。同时,选用α-半乳糖苷酶作为食品级选择标记、β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为报告基因构建了在GALl启动子和MFαl信号肽控制指导下的食品级分泌表达载体YGMPA-PM:并以α-凝集素C-端320个氨基酸为锚定序列,构建了能够展示表达p-1,3-1,4-葡聚糖酶的食品级展示表达载体YGMPNA-PM.将构建的载体和不同GAL基因型的重组酵母相结合,得到了适合工业化生产的食品级高效分泌表达系统和食品级高效展示表达系统。主要研究结果如下：扩增了GAL4结构基因全长序列,并构建了包含GAL4基因+KanMX表达盒的模板质粒PMD18-TGK.通过同源重组以GAL4+KanMX表达盒替换了工业三倍体酵母MS-1的三个等位的GALl基因中的一个,得到具有双GAL4的重组酵母。以KanMX为敲除框架,敲除了MS-l染色体上的一个GALl基因。利用LFH原理,设计了另外两套基因敲除框架KanMX+GALls和GALlt+KanMX,依次敲除了双GAL4重组菌株染色体上剩余的两个GALl等位基因。考虑到重组菌株应用的安全性,利用Cre/loxP系统切除了构建重组酿酒酵母菌株时使用的KanMX抗性表达盒,并通过传代使Zeocin抗性质粒pSH47/ZEO丢失,得到不同GAL基因型的重组酵母SGl、DG115.DPG65和GQ21。其中,重组菌株GQ21染色体上三个GALl基因全部缺失,且其中一个GALl基因位点被整合了一个GAL4基因拷贝。对不同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21在含有不同碳源的培养基中的生长、发酵性能以及抗性和遗传稳定性进行了测试。结果表明,重组酵母的GAL基因型在传代过程中保持稳定,没有发生回复突变且抗性基因已经被彻底删除。GALl基因的缺失对重组菌株对葡萄糖的利用有轻微地影响。不同的培养方式影响重组酵母对半乳糖的利用。在YPG培养基中,GALl基因敲除对酵母利用半乳糖的影响并不明显,MS-1.SGl.DG115在20 h内将培养基中的半乳糖全部消耗完毕,DPG65则在26 h内将半乳糖利用完毕。在YPGL培养基中,MS-1、SG1.DG115和DPG65利用完半乳糖的时间分别为20 h、44 h、44 h和68 h。在两种培养模式中,GQ21培养基中的半乳糖浓度一直维持不变,表明GALl基因确实已经被完全敲除。GALl基因的敲除和GAL4基因拷贝的增加没有改变重组菌株的热致死温度。重组菌株和对照菌株的热致死温度仍然是54℃。构建了PGKl启动子控制下的α-半乳糖营酶表达单元,并将此表达单元克隆到多拷贝质粒YEPlacl 81上构建了食品级克隆载体YPM.YPM转化酵母后得到的重组子可以在以蜜二糖为唯碳源的培养基中生长,并能在涂有X-α-gal的培养上显蓝色,表明α-半乳糖苷酶已经被有效表达。重组酵母/YPM在YPD培养基和MSD培养基中表达的a-半乳糖苷酶酶活最高为104 U/m1和41.72 U/ml；对照菌株安琪酵母表达的α-半乳糖苷酶存在蜜二糖／葡萄糖诱导-抑制效应,在YPD培养基和MSD培养基中的最高酶活为29.79 U/ml和266.38U/mI。在MSD培养基中,安琪酵母12h进入对数生长期,32 h进入稳定期；重组酵母YPM在68 h后才开始快速生长,164 h后进入稳定期。两者在YPD培养基中的生长性能一致,8 h进入对数生长期,32 h达到稳定期。扩增了GALl启动子、MFal信号肽以及ADHl终止子基因序列,以p-1,3-1,4-葡聚糖酶为报告基因在克隆载体YPM的基础上构建了食品级分泌表达载体YGMPA-PM.以α-半乳糖苷酶为筛选标记,将载体YGMPA-PM转入所构建的重组酵母菌株SG1、DG115、DPG65和GQ21以及MS-1,在蜜二糖平板（MSD）挑选出了转化子。测定不同GAL基因型酵母中p-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达水平。结果表明,SG1、DG115、DPG65和GQ21的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最高酶活分别为1523.48 U/ml、2480.43 U/ml、3161.53 U/ml和3991.00 U/ml,为MS-1 （846.37U/ml）的1.8倍、2.93倍、3.73和4.72倍,说明酵母染色体上GALI基因的敲除和GAL4基因拷贝的增加确实有利于提高外源蛋白表达的水平。重组分泌表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适温度为40℃,最适pH为6.0。50℃保温2 h后p-1,3-1,4-葡聚糖酶残留酶活为51.90%；60℃保温2 h后的活力下降为初始酶活的20.14%。在pH4-6的范围内于4℃放置24 h,酶活仍能保持80%以上。扩增了编码α-凝集素C-末端320个氨基酸的基因序列并在载体YGMPA-PM的基础上构建了食品级展示表达载体YGMPNA-PM.将其与不同GAL基因型的重组酵母相结合构建了食品级展示表达系统。此展示表达系统将p-1,3-1,4-葡聚糖酶成功展示表达在酿酒酵母细胞表面。通过平板鉴定和酶活测定确证了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的正确定位。SG1、DG115、DPG65和GQ21展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最高酶活分别为84.98 U/ml、118 U/ml、161.55 U/ml和201.87 U/ml,分别为MS-1 （45.10 U/ml）的1.88倍、2.62倍、3.56倍和4.48倍。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生改变。最适温度变为60℃,热稳定性也被增强。50℃保温3 h对酶活几乎没有影响；60℃保温1 h残留酶活为初始酶活的129.2%,60℃保温3 h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%,3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH4-7的范围内稳定性较好。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 名词缩写表
• 第一章 文献综述
• 1 基因工程表达系统研究进展
• 1.1 原核表达系统及其应用
• 1.2 真核表达系统及其应用
• 1.2.1 丝状真菌表达系统
• 1.2.2 植物表达系统
• 1.2.3 昆虫表达系统
• 1.2.4 哺乳动物表达系统
• 1.2.5 酵母表达系统
• 1.3 食品级表达系统研究进展
• 1.3.1 食品级表达系统的提出和定义
• 1.3.2 食品级表达系统研究进展
• 1.3.3 食品级酵母表达系统的构建
• 2 GAL基因家族调控系统和外源基因的表达
• 2.1 GAL基因的结构和功能
• 2.2 GAL基因的调控机制
• 2.3 GAL基因和外源蛋白的表达
• 3 酵母细胞表面展示技术（Yeast Surface Display,YSD）
• 3.1 酵母细胞表面展示表达系统构成
• 3.1.1 载体
• 3.1.2 外源表达蛋白
• 3.1.3 宿主菌株
• 3.2 几种酵母细胞表面展示表达系统
• 3.2.1 凝集素展示表达系统
• 3.2.2 絮凝素展示表达系统
• 3.2.3 其它酿酒酵母表面展示表达系统（表1-4）
• 3.3 酿酒酵母细胞表面展示表达系统应用
• 3.3.1 展示表达各种酶蛋白作为生物催化剂
• 3.3.2 环境治理中展示表达金属蛋白
• 3.3.3 蛋白质分子的相互作用及组合蛋白库的构建
• 3.3.4 可作为生物传感器的荧光蛋白的展示表达
• 3.3.5 免疫学中的应用
• 3.4 目前酿酒酵母表面展示表达系统存在的缺陷
• 4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶研究进展
• 4.1 p-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源
• 4.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶分子生物学研究进展
• 4.2.1 编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因以及酶基因的改造和表达
• 4.2.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的生物化学性质
• 4.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的结构和功能研究
• 4.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶在工业生产中的应用
• 4.4.1 在啤酒工业中的应用
• 4.4.2 在饲料工业中的应用
• 5 选题背景和研究内容
• 5.1 选题背景
• 5.2 研究内容
• 第二章 酵母染色体GAL1基因敲除和双重GAL4基因构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、主要试剂及仪器设备
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂及其配制
• 1.1.4 主要仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 酵母基因组提取
• 1.2.2 PCR条件
• 1.2.3 质粒的提取
• 1.2.4 酶切和连接
• 1.2.5 PCR片段和T载体的连接
• 1.2.6 琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备和转化
• 1.2.8 质粒的快速鉴定
• 1.2.9 DNA乙醇沉淀
• 1.2.10 酿酒酵母感受态细胞制备和电转化
• 1.2.11 Cre重组酶的诱导表达和Kan.丢失菌株的筛选
• 2 结果与分析
• 2.1 酵母基因组的提取
• 2.2 酵母染色体第一个GAL1基因敲除
• 2.2.1 GAL1基因敲除和重组子的鉴定
• 2.2.1 KanMX抗性表达盒的删除
• 2.3 酵母染色体上双GAL4基因构建
• 2.3.1 构建模板质粒PMD18-TGK
• 2.3.2 双GAL4基因构建和重组子的鉴定
• 2.3.3 KanMX抗性表达盒的删除
• 2.4 酵母染色体第二个GAL1基因的敲除
• 2.5 酵母染色体第三个GAL1基因的敲除
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 重组GAL菌株的生长和发酵性能以及遗传稳定性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、主要试剂及仪器设备
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 重组菌的传代培养
• 1.2.2 不同GAL基因型遗传稳定性鉴定
• 1.2.3 重组菌G418和Zeocin抗性丢失的遗传稳定性鉴定
• 1.2.4 葡萄糖培养基中的生长性能试验
• 1.2.5 甘油培养基中的生长性能试验
• 1.2.6 半乳糖培养基中的生长性能试验
• 1.2.7 HPLC测定半乳糖含量
• 1.2.8 热致死温度试验
• 2 结果与分析
• 2.1 重组菌株的GAL基因型遗传稳定性
• 2.2 重组菌株的抗性丢失遗传稳定性
• 2.3 重组菌株在葡萄糖培养基中的生长性能
• 2.4 不同的诱导模式对重组菌株生长性能以及半乳糖利用的影响
• 2.4.1 半乳糖标准曲线
• 2.4.2 不同的诱导模式下重组菌株的生长性能和半乳糖含量的变化
• 2.5 重组菌株的热致死温度
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 构建以α-半乳糖苷酶为食品级筛选标记的克隆载体
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、主要试剂及仪器设备
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计和PCR扩增
• 1.2.2 质粒的提取、酶切和连接
• 1.2.3 片段和T载体的连接
• 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.5 大肠杆菌感受态细胞制备和转化
• 1.2.6 酿酒酵母感受态细胞制备和电转化
• 1.2.7 α-半乳糖苷酶表达的平板鉴定
• 1.2.8 α-半乳糖苷酶活性测定
• 1.2.9 重组菌株的生长性能测定
• 2 结果与分析
• 2.1 产α-半乳糖苷酶的酵母菌株筛选
• 2.2 食品级克隆载体的构建
• 2.2.1 质粒YEPlac 181的提取
• 2.2.2 PGKI启动子的扩增
• 2.2.3 α-半乳糖苷酶基因的扩增
• 2.2.4 克隆载体YPM的构建
• 2.3 重组质粒的转化和α-半乳糖苷酶表达的平板鉴定
• 2.4 α-半乳糖苷酶的活性测定
• 2.4.1 对硝基酚标准曲线
• 2.4.2 α-半乳糖甘酶酶活测定
• 2.5 重组菌株的生长性能
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 食品级酿酒酵母高效分泌表达系统构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、主要试剂及仪器设备
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计和PCR扩增
• 1.2.2 质粒的提取、酶切和连接
• 1.2.3 片段和T载体的连接
• 1.2.4 大肠杆菌感受态细胞制备和转化
• 1.2.5 DNA乙醇沉淀
• 1.2.6 枯草芽孢杆菌基因组提取
• 1.2.7 酿酒酵母感受态细胞快速制备和电转化
• 1.2.8 酿酒酵母阳性转化子的筛选
• 1.2.9 p-1,3-1,4-葡聚糖酶的诱导分泌表达
• 1.2.10 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性测定
• 1.2.11 β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究
• 2 结果与分析
• 2.1 枯草芽孢杆菌基因组的提取
• 2.2 片段的扩增
• 2.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的扩增
• 2.2.2 GAL1启动子基因的扩增
• 2.2.3 MFal信号肽基因的扩增
• 2.2.4 ADH1终止子基因的扩增
• 2.3 表达载体YGMPA-PM的构建
• 2.3.1 构建载体YGM
• 2.3.2 构建载体YGMPA
• 2.3.3 表达载体YGMPA-PM的构建
• 2.4 重组载体YGMPA-PM的转化和重组子鉴定
• 2.5 p-1,3-1,4-葡聚糖酶在不同GAL菌株中的表达
• 2.5.1 β-葡聚糖标准曲线
• 2.5.2 不同GAL菌株β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达
• 2.6 重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质
• 2.6.1 最适pH
• 2.6.2 pH稳定性
• 2.6.3 最适反应温度
• 2.6.4 热稳定性
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六章 食品级酿酒酵母高效展示表达系统构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、主要试剂及仪器设备
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器和设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计和PCR扩增
• 1.2.2 质粒的提取、酶切和连接
• 1.2.3 片段和T载体的连接
• 1.2.4 大肠杆菌感受态细胞制备和转化
• 1.2.5 DNA乙醇沉淀
• 1.2.6 酿酒酵母感受态细胞快速制备和电转化
• 1.2.7 酿酒酵母转化子的筛选
• 1.2.8 β-1,3-1,4-葡聚糖酶展示表达的诱导条件
• 1.2.9 展示表达p-],3-1,4-葡聚糖酶的酵母细胞收集
• 1.2.10 展示表达的p-1,3-1,4-葡聚糖酶活性测定
• 1.2.11 展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质测定
• 2 结果与分析
• 2.1 表达载体YGMPNA-PM的构建
• 2.1.1 凝集素基因片段的扩增
• 2.1.2 片段PN的连接
• 2.1.3 展示表达载体YGMPNA-PM的构建
• 2.2 重组质粒的转化和重组子的平板鉴定
• 2.3 p-1,3-1,4-葡聚糖酶的定位
• 2.4 不同GAL菌株对p-1,3-1,4-葡聚糖酶展示表达的影响
• 2.5 展示表达的β-l,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质
• 2.5.1 最适反应温度
• 2.5.2 热稳定性
• 2.5.3 最适pH
• 2.5.4 pH稳定性
• 3 讨论
• 4 小结
• 第七章 结论和展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附:个人简历及攻读博士学位期间发表的论文