α-Synuclein的自噬性降解途径及可能机制

论文摘要

第一部分突变型α-synuclein的自噬性降解途径及可能机制目的观察PC12细胞中突变型α-synuclein与自噬之间的关系和可能的降解途径,探讨其在帕金森病发病机制中的作用。方法采用RT-PCR方法从人胎脑中克隆野生型α-synuclein基因,采取T-A克隆基因并测定其序列,在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变构建α-synuclein同义突变基因和致病突变A30P的α-synuclein基因并进行测序;对转染了α-synuclein（A30P）的PC12细胞进行药物干预,检测细胞的增殖活性和CAT、SOD的水平,还采用透射电镜观察细胞超微结构改变以及自噬的特征行改变,同时检测α-synuclein、LC3的蛋白的表达。结果突变型α-synuclein激活了自噬途径,并加剧了MPP+的毒性作用,对于转染突变型α-synuclein（A30P）的PC12细胞,形态学上明确有自噬现象的发生,自噬确实参与了变异型α-synuclein（A30P）的降解,从分子生物学角度也检测到LC3-Ⅱ在转染突变型α-synuclein（A30P）的PC12细胞中的表达。自噬抑制剂Wortmannin可加剧α-synuclein积聚和导致细胞死亡, LC3-Ⅱ的表达也受到抑制,而自噬诱导剂Rapamycin则可以促进α-synuclein的降解和细胞生长,LC3-Ⅱ的表达显著增强。结论转染突变型α-synuclein（A30P）的PC12细胞在形态学上明确有自噬现象的发生,在MPP+作用下,突变型α-synuclein的表达水平明显增高,α-synuclein的异常积聚导致PC12细胞的死亡,而促进自噬有助于突变型α-synuclein的降解,对细胞具有保护作用。第二部分突变型α-synuclein（A30P）在氧化应激状态下的降解途径和可能机制目的观察突变型α-synuclein（A30P）在氧化应激状态下的降解途径,探讨其在帕金森病发病机制中的作用和可能机制。方法利用MPP+对转染了α-synuclein（A30P）的PC12细胞进行干预,模拟在氧化应激状态下的PD细胞模型,在此基础上,分别给予自噬诱导剂—Rapamycin和抑制剂—Wortmannin,检测细胞的增殖活性,还采用透射电镜观察细胞超微结构改变以及自噬的特征行改变,同时检测α-synuclein、LC3蛋白的表达和细胞培养基中CAT、SOD的水平。结果在氧化应急状态下（MPP+）,突变型α-synuclein的表达明显增加,自噬水平显著减低;细胞超微结构显示:线粒体肿胀、空泡化,嵴少,内质网扩张,细胞核皱缩,染色质有边集,细胞有凋亡的倾向。而联合使用自噬抑制剂-Wortmannin处理过细胞,细胞培养液中CAT和SOD的水平较单独应用MPP+的细胞有显著降低,细胞增殖活性明显降低,细胞死亡明显增加;α-synuclein的表达明显增加,自噬水平显著减低;细胞超微结构显示:线粒体肿胀,嵴少,内质网扩张,细胞核皱缩,染色质有边集,并可见凋亡小体。相反,联合使用自噬诱导剂-Rapamycin提高了细胞培养液中CAT和SOD水平,促进了细胞的增殖和分化;α-synuclein的表达明显减低,自噬水平显著增高;细胞超微结构显示:胞质中可见多个具有特征性双层膜结构的自噬小体,胞核、线粒体正常。结论在氧化应激状态下,突变型α-synuclein（A30P）对外源性毒素的敏感性明显增高,α-synuclein聚集更为显著,自噬水平明显减低,从而导致自噬应激;提高自噬水平有助于突变型α-synuclein的降解,对细胞具有保护作用。第三部分Rapamycin治疗帕金森病小鼠模型的实验研究及可能机制目的探讨自噬诱导剂—Rapamycin对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的帕金森病（PD）小鼠模型是否具有治疗作用及可能机制。方法Rapamycin采用静脉直接给药对MPTP诱导的PD小鼠模型进行治疗,而后采用免疫组织化学及蛋白印迹分析（Western blot）的方法对PD相关标志物酪氨酸羟化酶（TH）以及α-synuclein的可能改变进行检测,并采用高效液相色谱-电化学检测仪（HPLC-ECD）检测纹状体单胺类递质的可能变化;还采用透射电镜观察细胞超微结构改变以及自噬的特征行改变。为进一步研究自噬在异常积聚的α-synuclein降解过程中的作用,我们对其中一个关键的自噬基因-微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3, LC3）进行检测分析。结果（1）黑质免疫组化染色显示:NS治疗组较正常对照组TH阳性细胞数明显减少（p=0.003）, Rapamycin治疗组可逐渐恢复TH阳性细胞损失;（2）纹状体Western blot结果显示:Rapamycin治疗组较NS治疗组TH表达明显增多;Rapamycin治疗组与NS治疗组比较α-synuclein明显下降（p=0.004）;Rapamycin治疗组较NS治疗组LC3明显升高（p=0.003）。（3） HPLC-ECD显示DA及其代谢产物DOPAC在NS治疗组明显下降,而其他单胺类递质则无明显改变;治疗组DOPAC含量较NS治疗组明显升高（p=0.001）,与正常对照组无明显差异。（4） NS治疗组较正常对照组DAT和VMAT-2表达明显减少,而Rapamycin治疗组较NS治疗组DAT和VMAT-2表达明显增多,但是通过对比,我们可以发现:Rapamycin治疗组较NS治疗组DAT和VMAT-2升高的程度有明显的差异,与正常对照组比较,Rapamycin治疗组DAT的表达仍低于对照组,而VMAT-2表达却明显高于对照组。DAT和VMAT-2对MPTP的敏感性不同,在经过MPTP后,二者对Rapamycin的反应也存在明显的差异。结论静脉注射Rapamycin可以对MPTP诱导的小鼠PD模型产生明显的治疗作用; Rapamycin不但可以减少DA能神经元死亡,还能够恢复DA能神经元的功能,从而增加了DOPAC的含量;Rapamycin的治疗作用可能与促进异常积聚的蛋白α-synuclein的降解有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 突变型α-synuclein 的自噬性降解途径及可能机制
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 突变型α-synuclein（A30P）在氧化应激状态下的降解途径和可能机制
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 Rapamycin 治疗帕金森病小鼠模型的实验研究及可能机制
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述 α-Synuclein及其在帕金森病发病机制中的可能机制
• 在读期间撰写论文及科研情况
• 英汉主要缩略词表
• 致谢