人参皂苷Re基于多靶点理论的抗阿尔茨海默病作用研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是老年患者记忆障碍的常见原因,随着世界人口趋向老龄化,该病的发病率正日益增加,AD的病理学特征是患者脑内存在老年斑（senile plaque,SP）,神经原纤维缠结（neuro fibrillary tangles,NFT）以及神经元丢失。AD严重威胁着老年患者的健康,AD患者表现为进行性记忆功能减退,语言功能下降,认知功能障碍。尽管AD发病机制尚未研究清楚,许多因素在AD的发病机理中起着重要的作用,例如,β-淀粉样蛋白和tau蛋白的聚集、金属离子过量(例如Cu2+,Zn2+,Fe3+)、氧化应激以及乙酰胆碱水平下降等。这就为抗AD药物的发现提供了更多靶点。目前,大量的合成或天然的分子化合物已经用来减少β-淀粉样蛋白的生成（例如β-分泌酶抑制剂）,阻止β-淀粉样蛋白或tau蛋白的聚集,螯合金属离子,减轻活性氧损伤,抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）或单胺氧化酶（MAO）以达到治疗AD的目的。然而,单一靶点存在着局限性,这就使得寻找组合方法治疗AD变得更加迫切。本研究依据雌激素受体β亚型细胞信号转导理论,建立基于细胞和报告基因的药物筛选模型。在药物筛选的过程中将功能性反应作为筛选指标,在细胞水平上对可以改变转录因子活性或影响细胞调控的小分子进行筛选,根据这一原理我们首先构建含有雌激素应答序列（estrogen responsive element,ERE）靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入人胚胎肾细胞（HEK293）中等到稳定转染重组表达载体的单克隆细胞株,并对此模型进行评价,结果显示本研究建立了高效、灵敏、可以筛选具有雌激素β亚型激动剂样活性的化合物的细胞模型,利用本细胞模型筛选有机小分子化合物342个,筛选样品达1000多次。人参皂苷Re表现出弱的雌激素受体β亚型激动剂样活性作用。我们同样还建立了基于报告基因和核转录因子（nuclear factor-kappa B,NF-κB）信号通路的细胞筛选模型,构建含有NF-κB靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入人胚胎肾细胞（HEK293）中得到稳定转染的重组表达载体的单克隆细胞株,并对此模型进行评价。人参皂苷Re可以抑制脂多糖引起的NF-κB信号通路的诱导表达增加。实验结果表明,人参皂苷Re对神经细胞的保护作用机理不是单一的,其药效是多种机理综合作用的结果。应用5mmol·L-1高浓度的谷氨酸（glutamate,Glu）与PC12细胞短暂共孵育后无血清培养24h,能引发迟发性神经毒性,100μmol·L-1和10μmol·L-1人参皂苷Re对Glu诱导的PC12细胞损伤有保护作用,能增加细胞的存活率并抑制LDH释放。10μmol·L-1人参皂苷Re能降低D-Hanks液中的静息状态游离钙的浓度;100μmol·L-1和10μmol·L-1人参皂苷Re能抑制KCl诱导的[Ca2+]i增高;1mmol·L-1、100μmol·L-1和10μmol·L-1人参皂苷Re抑制Glu诱导的[Ca2+]i增高,因此人参皂苷Re可能通过抑制细胞膜上的钙通道,减少细胞外钙内流和细胞内钙释放而减低细胞内游离钙的增加,从而对谷氨酸诱导的神经毒性有保护作用。本实验还从膜脂流动性等指标观察了人参皂苷Re对谷氨酸所致大鼠原代神经细胞损伤的保护作用。建立大鼠原代神经细胞谷氨酸损伤模型,以1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（DPH）为探针,用荧光偏振法测定荧光偏振度（P）值和微粘度（η）,研究细胞膜脂流动性的改变;MTT（四甲基偶氮唑盐）法、培养介质乳酸脱氢酶（LDH）活力测定观察人参皂苷Re的保护作用。结果人参皂苷Re组荧光偏振度和微粘度低于谷氨酸损伤组,且呈现剂量依赖关系。人参皂苷Re组原代神经细胞LDH的释放减少,吸光度增加,但人参皂苷Re对正常细胞增殖无影响。说明人参皂苷Re对谷氨酸所致的大鼠原代神经细胞损伤具有保护作用,其保护作用可能与人参皂苷Re改善神经细胞膜脂流动性有关。实验结果表明,经10μmol·L-1Aβ1-40处理后的SHSY5Y细胞对MTT的还原能力下降,细胞活力明显下降,LDH释放增加。人参皂苷Re 10μmol·L-1能明显改善细胞存活能力,降低LDH释放。我们选用SD大鼠为研究对象,制备了阻断大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血（MCAO）再灌注模型,考察人参皂苷Re对大鼠脑缺血再灌注后线粒体肿胀度的影响和H+-ATP酶的作用。研究结果表明,人参皂苷Re（5、10、20mg/kg）连续7天灌胃给MCAO再灌注大鼠后,可以降低线粒体的肿胀度,防止H+-ATP酶活性的降低。综上结果表明:人参皂苷Re对与阿尔茨海默病相关的多个靶点都有作用。人参皂苷Re有雌激素受体β亚型激动剂样活性,具有抗炎作用,抑制钙超载,拮抗β淀粉样蛋白的损伤,改善神经细胞膜脂流动性,减轻线粒体的肿胀度,抑制线粒体H+-ATP酶活性的下降。

论文目录

摘要

Abstract

缩略词表（ABBREVIATIONS）

第一章绪论

第一节阿尔茨海默病发病机制研究

第二节治疗阿尔茨海默病药物研究进展

第三节报告基因技术理论基础及其应用

第四节人参皂苷Re药理学作用研究进展

参考文献

第二章人参皂苷Re抗阿尔茨海默病作用研究

第一部分人参皂苷Re基于报告基因和雌激素受体β亚型信号通路的抗阿尔茨海默病作用

一、实验材料

二、实验方法

2.1 重组表达载体的构建

2.2 细胞模型建立

2.3 G418筛选阳性克隆细胞株的浓度确定

2.4 稳定转染

2.5 β-gal的检测

2.6 报告基因的检测

2对SEAP诱导表达的量效关系'>2.7 E₂对SEAP诱导表达的量效关系

2对SEAP诱导表达的时效关系'>2.8 E₂对SEAP诱导表达的时效关系

2对细胞增殖功能的影响'>2.9 E₂对细胞增殖功能的影响

2.10 模型特异性考察

2.11 模型稳定性评价

2.12 免疫细胞化学染色

2.13 模型应用——样品的筛选

三、实验结果

3.1 细胞株的选择

3.2 G418作用剂量的选择

3.3 阳性克隆筛选

2对SEAP诱导表达的量效关系'>3.4 E₂对SEAP诱导表达的量效关系

2对SEAP诱导表达的时效关系'>3.5 E₂对SEAP诱导表达的时效关系

2对细胞增殖功能的影响'>3.6 MTT实验考察E₂对细胞增殖功能的影响

3.7 模型的稳定性考察

3.8 模型的特异性考察

3.9 免疫细胞化学染色

四、讨论

小结

参考文献

第二部分人参皂苷Re对兴奋性氨基酸神经毒性的抑制作用

第一节人参皂苷Re对谷氨酸诱导的细胞损伤的影响

一、实验材料

二、实验方法

2.1 细胞处理

2.2 药物处理

2.3 MTT法测定细胞存活能力

2.4 LDH活性测定

2.5 统计学处理

三、实验结果

3.1 谷氨酸损伤模型的建立

3.2 细胞形态学观察

3.3 MTT法测细胞活力

3.4 Re对LDH释放的影响

第二节人参皂苷Re对神经细胞内游离钙浓度的影响

一、实验材料

二、实验方法

2.1 细胞准备

2.2 负载Fura-2/AM

2.3 去除细胞外Fura-2/AM

2.4 荧光测定

2+]i计算'>2.5 细胞胞质游离钙浓度[Ca²⁺]i计算

2.6 药物处理

2.7 统计学处理

三、实验结果

3.1 静息状态游离钙测定

3.2 Re对Glu引起的钙内流的影响

3.3 Re对KCl引起的钙内流的影响

四、讨论

小结

参考文献

第三部分人参皂苷Re对大鼠海马原代神经细胞损伤的保护作用

一、实验材料

二、实验方法

2.1 大鼠海马原代神经细胞的分离和培养

2.2 谷氨酸损伤模型的建立

2.3 膜蛋白的测定

2.4 荧光偏振度法测定神经细胞膜脂流动性

2.5 MTT法测定细胞存活能力

2.6 LDH活性测定

2.7 人参皂苷Re对正常原代神经细胞增殖功能的影响

三、实验结果

3.1 原代培养海马神经细胞形态学观察

3.2 人参皂苷Re对谷氨酸所致大鼠原代神经细胞损伤荧光偏振度的影响

3.3 人参皂苷Re对谷氨酸所致大鼠原代神经细胞损伤微粘度的影响

3.4 人参皂苷Re对谷氨酸所致大鼠原代神经细胞损伤细胞存活能力的影响

3.5 人参皂苷Re对谷氨酸所致大鼠原代神经细胞损伤LDH释放活性的影响

3.6 人参皂苷Re对正常原代神经细胞增殖功能的影响

四、讨论

小结

参考文献

第四部分人参皂苷Re对β-淀粉样蛋白损伤的作用

一、实验材料

二、实验方法

1-40的"老化"处理'>2.1 Aβ_1-40的"老化"处理

2.2 细胞干预处理

1-40对SHSY5Y细胞的影响'>2.3 Aβ_1-40对SHSY5Y细胞的影响

1-40所致SHSY5Y细胞损伤的保护作用'>2.4 Re对Aβ_1-40所致SHSY5Y细胞损伤的保护作用

2.5 MTT法测定细胞存活能力

2.6 LDH活性测定

2.7 统计学处理

三、实验结果

1-40致SHSY5Y细胞损伤作用的量效关系'>3.1 Aβ_1-40致SHSY5Y细胞损伤作用的量效关系

1-40致SHSY5Y细胞损伤作用的时效关系'>3.2 Aβ_1-40致SHSY5Y细胞损伤作用的时效关系

1-40致SHSY5Y细胞损伤保护作用的量效关系'>3.3 Re对Aβ_1-40致SHSY5Y细胞损伤保护作用的量效关系

1-40致SHSY5Y细胞损伤保护作用的时效关系'>3.4 Re对Aβ_1-40致SHSY5Y细胞损伤保护作用的时效关系

四、讨论

小结

参考文献

第五部分 Re基于报告基因和NF-κB信号通路的抗炎药物细胞筛选模型的建立和应用

一、实验材料

二、实验方法

2.1 重组表达载体的构建

2.2 细胞培养及载体DNA的转染

2.3 SEAP化学发光检测和β-gal的检测

2.4 HygB筛选阳性克隆细胞株浓度的确定

2.5 LPS对SEAP诱导表达的时效和量效关系

2.6 PDTC对SEAP报告基因表达的影响

2.7 LPS对细胞增殖功能的影响

2.8 模型稳定性考察

2.9 模型的应用

三、实验结果

3.1 HygB作用剂量的选择

3.2 LPS对SEAP诱导表达的时效和量效关系

3.3 PDTC剂量的选择

3.4 MTF实验考察LPS对细胞增殖功能的影响

3.5 模型的稳定性考察

3.6 Re对LPS诱导的NF-κB信号通路的抑制作用

3.7 MTT实验考察Re对细胞增殖功能的影响

四、讨论

小结

参考文献

第六部分人参皂苷Re对大鼠脑缺血再灌注损伤线粒体的保护作用

一、实验材料

二、实验方法

2.1 动物分组及大鼠MCAO模型制备

2.2 模型鉴定

2.3 脑线粒体提取

2.4 线粒体肿胀度检测

2.5 脂质过氧化产物MDA测定

+-ATP酶活性检测'>2.6 H⁺-ATP酶活性检测

2.7 统计学处理

三、实验结果

3.1 人参皂苷Re对线粒体肿胀度的影响

3.2 人参皂苷Re对过氧化产物MDA生成的影响

+-ATP酶活性的影响'>3.3 人参皂苷Re对H⁺-ATP酶活性的影响

四、讨论

小结

参考文献

结论

致谢

附表

个人简历

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