论文摘要
目的：观察丹参酮（TAN）对经肿瘤坏死因子-a（TNF-a）作用致骨关节炎模型的体外培养家兔软骨细胞的增殖能力及氧自由基代谢的影响。以探讨丹参酮对软骨细胞的保护机制，从分子水平揭示益气活血药物—丹参治疗骨性关节炎的机理，从而进一步更好的指导临床应用。方法：采用体外培养家兔膝关节软骨细胞的方法，取第一代至第三代软骨细胞为实验所用。将培养成功的兔膝关节软骨细胞进行甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定软骨细胞。将软骨细胞分成8组种于96孔培养板，每组12平行孔。空白对照组为正常生长的软骨细胞。实验对照组加入肿瘤坏死因子-a作用的软骨细胞。丹参酮用细胞培养液配制成6个浓度，除空白对照组和实验对照组之外，其他软骨细胞组加入不同浓度丹参酮和肿瘤坏死因子-a。待细胞80％贴壁后，进行MTT法测定软骨细胞的增殖，以观察何种浓度的丹参酮对软骨细胞有增殖作用。选择其中两种增殖作用确切的丹参酮浓度。复取软骨细胞种于24孔培养板，贴壁后，将软骨细胞分为四组，除空白对照组之外，在其他组细胞培养液中加入肿瘤坏死因子-a诱导软骨细胞凋亡，模仿膝骨性关节炎时的病理变化。除实验对照组外，其他两组培养液中加入两种浓度的丹参酮。培养72小时后，测定培养液中超氧化物歧化酶（SOD）及诱导型一氧化物合酶（iNOS）的浓度，以观察丹参酮对细胞的氧自由基代谢的影响。结果：1甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性反应。2 MTT法测定软骨细胞活性，丹参酮一组（浓度5μg／ml）丹参酮二组（7.5μg／ml）丹参酮三组（10μg／ml）和实验对照组比较有统计学意义，其中丹参酮一组及丹参酮三组与实验对照组相比有显著统计学意义（p＜0.01），丹参酮四组（15μg／ml）丹参酮五组（20μg／ml）丹参酮六组（50μg／ml）与实验对照组比较无统计学意义（p＞0.05）。3对超氧化物歧化酶（SOD）的影响：空白对照组关节软骨细胞SOD活性的表达高于实验对照组；5μg／ml浓度丹参酮组可以显著提高SOD活性，与实验对照组和空白对照组相比有显著性差异（p＜0.01）；10μg／ml浓度丹参酮组也可提高SOD活性表达，与空白对照组相比无显著性差异（p＞0.05），与实验对照组相比有显著性差异（p＜0.05）。4对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的影响：空白对照组有少量iNOS活性表达；两种浓度丹参酮组的细胞培养液中的iNOS活性与实验对照组相比有显著性的差异；5μg／ml浓度丹参酮组软骨细胞的iNOS活性与空白对照组相比无显著性差异；10μg／ml丹参酮组软骨细胞的iNOS活性与空白对照组相比有显著性差异，表明稍高浓度的丹参酮可以有效抑制iNOS的活性。结论：1一定浓度的丹参酮可以保护软骨细胞活性。2一定浓度丹参酮可以提高细胞SOD的活性，抑制iNOS的活性表达，可以减轻TNF-α对软骨细胞的破坏。提示丹参治疗骨性关节炎的机制可能与其促进细胞增殖及抗自由基作用有关。