论文摘要
肝癌是国内常见的恶性肿瘤之一,其侵袭转移与复发是患者死亡的主要原因之一。因此,探索肝癌侵袭转移与复发的发生机制,寻求有效的抗肝癌转移与复发治疗措施,对改善肝癌患者的预后具有重要意义。在肝癌侵袭转移与复发中,HGF/c-Met信号系统的“对话”有着重要地位,这一作用在肝癌切除术后,残留肝脏再生,致HGF/c-Met系统处于活跃的状态,从而促进残留肝癌细胞增殖使其与肝癌术后转移、复发的关系也表现尤为突出。HGF/c-Met信号系统在肝癌侵袭转移与复发中的重要地位,也为肝癌侵袭转移与复发的治疗提供了新的靶点。当前,已发现多种HGF/c-Met信号的抑制剂,但所发现的HGF/c-Met抑制剂都有不同程度局限,如HGF竞争性拮抗剂NK4,c-Met受体的选择性抑制剂PHA-665752只能在一定程度上抑制HGF/c-Met信号,究其原因是HGF/c-Met与其它信号间的交互作用,如HGF/c-Met信号与整合素信号间的交互作用。有研究表明四跨膜蛋白CD151可与c-Met形成一功能复合物,并在HGF/c-Met信号转导以及其与其它信号间的交互作用中扮演重要的角色,可能为抑制HGF/c-Met信号的全新靶点。目前,国内外还没有CD151在肝癌中研究的报道,同时,CD151在HGF/c-Met信号中的作用也缺乏系统研究。本实验首先在肝癌、相应癌旁、正常肝组织以及不同转移潜能肝癌细胞系中检测CD151表达差异;研究其与肝癌发生、发展以及预后的相关性;通过转染与干扰调节CD151表达后,探讨CD151与肝癌细胞侵袭与转移的关系;最后对CD151在HGF/c-Met信号转导中的具体作用进行研究。第一部分四跨膜蛋白CD151在肝癌中的过表达目的:检测肝癌、癌旁和正常肝组织中四跨膜蛋白CD151的mRNA与蛋白表达,分析其与肝癌发生的关系。方法:应用普通RT-PCR,荧光定量PCR与免疫组织化学技术检测CD151在肝癌、相应癌旁、正常肝组织中的表达,并比较三组间CD151的表达差异。结果:CD151在肝癌、相应癌旁和正常肝组织中均有表达,相对表达量分别为3.6±0.9（0.5-8.2）,2.7±0.1（0.0-6.5）与1.8±0.8（0.0-3.1）,肝癌与相应癌旁组织间差异明显（p＜0.05）,CD151在癌旁与正常肝组织的表达也存在差异（p＜0.05）。免疫组织化学显示CD151主要分布于细胞膜,其在肝癌组织中的表达明显高于后两者（p＜0.05）。结论:四跨膜蛋白CD151在肝癌发生中可能有重要作用。第二部分CD151/或c-Met与肝癌临床病理特征及预后的关系目的:研究CD151和c-Met在原发性肝癌中表达,探讨CD151和c-Met与原发性肝癌的关系及临床生物学意义。方法:应用荧光定量PCR检测120例肝癌组织中CD151与c-Met mRNA的表达,组织芯片检测520例肝癌组织中CD151与c-Met蛋白的表达,SSPS11.5统计分析两者与肝癌临床病理特征及预后的关系。结果:CD151蛋白的过表达与肝癌患者的无包膜、高分期与分级、肿瘤细胞低分化、有门脉癌栓及多卫星灶等临床病理因素有关（p＜0.05）;而c-Met与有门脉癌栓、肿瘤直径＞0.5cm、多卫星灶、高分期与分级与肿瘤细胞低分化（p＜0.05）等相关。CD151与c-Met在肝癌中表达呈中度相关,有显著性意义（r=0.051,p=0.013）,CD151+组的3、5、7年生存率明显低于CD151组（p＜0.01）,CD151+/c-Met+组的3、5、7年生存率明显低于CD121-/c-Met+及CD151-/c-Met-组（p＜0.01）。结论:四跨膜蛋白CD151与原发性肝癌的侵袭、转移及不良预后相关;CD151对c-Met生物学功能可能存在影响。第三部分CD151表达与肝癌细胞侵袭与转移的关系目的:研究四跨膜蛋白CD151与肝细胞癌细胞侵袭与转移的关系。方法:荧光定量PCR,western blot及流式细胞仪检测不同转移潜能肝癌细胞中CD151的表达差异;转染pcDNA3-CD151cDNA与pGPU6/GFP/Neo-CD151,筛选出稳定细胞株,经western blot,流式细胞仪验证CD151表达改变后,明胶酶谱研究基质金属蛋白酶分泌变化;MTT检测CD151表达改变后,细胞增殖能力变化;transwell研究细胞侵袭能力改变。细胞接种于裸鼠体内,研究CD151表达改变后,细胞成瘤与肺转移能力的改变。结果:转染pcDNA3-CD151cDNA与pGPU6/GFP/Neo-CD151于低转移能力的HepG2与高转移的HCCLM3肝癌细胞,筛选的稳定细胞株CD151表达改变明显;明胶酶谱研究显示CD151的表达与MMP9的分泌呈正相关,而对MMP2的影响较小。肝癌细胞增殖受CD151表达水平影响较小（p＞0.05）:CD151高表达组细胞的移动与侵袭能力明显增强,肺转移灶明显增加,且以Ⅲ,Ⅳ期为主。结论:四跨膜蛋白CD151与肝癌的侵袭与转移正相关。第四部分CD151对HGF/c-Met信号转导的影响目的:研究CD151与c-Met在肝癌细胞中的关系及其对HGF/c-Met信号的影响。方法:免疫荧光与激光共聚焦研究两者在不同转移潜能肝癌细胞中的表达与相对分布;免疫共沉淀研究两者形成复合物情况。以HGF作用于CD151表达改变前后的细胞,western blot研究HGF/c-Met下游与肝癌转移相关的重要信号分子Akt、FAK、ERK1/2磷酸化差异,分析其在肝癌细胞中对HGF/c-Met信号的影响。结果:CD151与c-Met主要表达于肝癌细胞的细胞膜,分布一致;免疫共沉淀研究显示两者形成复合物。在HGF作用后,下游信号分子Akt与FAK在CD151表达不同的细胞,磷酸化差异明显（p＜0.05）,而ERK1/2的磷酸化在两组间无差异（p＞0.05）。结论:四跨膜蛋白CD151与c-Met在肝癌细胞中形成复合物,其通过Akt与FAK对HGF/c-Met产生影响。