论文摘要
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物，苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要来源于其在芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白，杀虫晶体蛋自结构和作用机制是目前国内外研究的一个热点；但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点，因此在了解杀虫晶体蛋白结构与功能关系的基础上，通过生物技术手段构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。本研究利用苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchi21基因重组获得高效杀虫工程菌株XBU-HUAccB5。从研究室保存的菌株Bt 4.0718（CCTCC No.M200016）出发，通过设计引物Ac-F／Ac-R和ter-F／ter-R，以其质粒为模版PCR扩增cry1Ac基因及cry1Ac基因的终止子下游序列，设计引物chi-F／chi-R从含有烟草几丁质酶cDNA的质粒中PCR扩增tchi21基因，用NcoⅠ酶切上述两步的PCR产物，回收两个酶切片段进行连接，以连接产物为模板，用chi-F／ter-R引物对扩增融合chi-ter片段，利用构建含Bt 4.0718菌株的cry1Ac基因质粒pUAc19和融合chi-ter片段用BglⅡ和SmaⅠ酶切、回收、连接，构建中间载体质粒pUAccB19，同时将质粒pUAccB19和穿梭表达载体pHT315用SalⅠ／SmalⅠ酶切，回收其目的片段，构建表达载体质粒pHUAccB5，将表达载体pHUAccB5电转化无晶体突变株XBU001获得重组菌株XBU-HUAccB5。对工程菌株XBU-HUAccB5经SDS-PAGE和Western blotting分析：工程菌株分别表达了130 kDa的Cry1Ac蛋白，同时还表达了30 kDa的几丁质酶蛋白，经Western blotting检测，工程菌株XBU-HUAccB5的Cry1Ac蛋白和几丁质酶的表达得到证实，经原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）观察显示，工程菌株XBU-HUAccB5产生晶体蛋白呈有规则的菱形；在对发酵液的几丁质酶酶活性检测中，无晶体突变株在的酶活发酵过程中一直保持在1.5U／ml，工程菌XBU-HUAccB5的几丁质酶酶活一直呈上升的趋势，在72h时达到最高峰为7.5U／ml，是无晶体突变株的5倍，几丁质酶活变化趋势与工程菌的生长曲线一致。生测结果显示：工程菌HTX-42（cry1Ac单价基因转XBU001）对初孵棉铃虫（Helicoverpa armigera Hubner）在48h的LC50是117.7780μg／ml，72h的LC50是89.8691μg／ml；工程菌XBU-HUAccB5（cry1Ac与几丁质酶tchi21双价基因转XBU001）对初孵棉铃虫在48h的LC50是10.4240μg／ml，72h的LC50是4.7904μg／ml。工程菌XBU-HUAccB5比工程菌HTX-42对棉铃虫的生测毒力处理在48h时高11.30倍，在72h高18.76倍。结果表明在72h内随着时间的延长，几丁质酶协同Cry1Ac杀虫的效果越显著。本研究已成功构建cry1Ac基因和tchi21基因融合的Bt工程菌，这对进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株，研制出超效、广谱、安全的杀虫剂，以克服Bt杀虫剂存在的杀虫毒力低、易产生抗性等问题的研究提供了新的技术途径。