猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及NSP2、ORF5基因的遗传变异分析

论文摘要

PRRS首先被报道于20世纪80年代的美国,之后迅速在世界各地传播。PRRS能引起猪繁殖障碍和呼吸道症状,该病起初被称为“神秘病”,现在被命名为猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome）。猪繁殖与呼吸综合征给全球养猪业带来巨大威胁。PRRS的病原为PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）,据报道,PRRSV比其它一些RNA病毒进化速率更快。最近,2006年中国爆发了一次“猪高热病”,引起这次疫病的主要病原为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）,临床症状主要表现为高发病率和高死亡率（20%）。为了更深入地了解中国PRRSV的流行状况,2006年爆发PRRS后遗传进化特征以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒可能的致病机理,我们开始了这项研究工作。在这项研究中,我们在2009年到2010年期间检测了1060份临床样品,测得了101株毒株的ORF5和部分NSP2基因序列,分析中国近年来PRRSV的流向状况和变异情况。这些样品分别从安徽,湖北,河南,广西,江西,福建,广东,河北,陕西等省份。我们的结果显示2009年PRRSV阳性率为71.71%,2010年PRRSV阳性率为54.03%,并且高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒在中国已经占据主导地位。通过氨基酸序列比对分析,在101株毒株中NSP2序列氨基酸相似性为83.6%-100%,ORF5同源性为89.5%-100%。进化树分析表明,这101株毒株都属于美洲型毒株,而且我们将美洲型毒株划分为4个亚类。另外,高致病性PRRSV（2006年后在中国广泛流行）的变异毒株在2009年再次出现。序列分析显示,绝大部分毒株在NSP2氨基酸序列中存在30个氨基酸的不连续缺失,个别出现其他类型的缺失。在ORF5编码的GP5蛋白中出现了大量氨基酸残基的替换,特别是在主要中和抗原表位（PNE）和潜在糖基化位点。与经典毒株相比,潜在糖基化位点的数量和位置都发生了改变。我们的研究表明,中国PRRSV毒株正在经历快速地演变,出现了一些变异,可能导致目前临床使用的疫苗失效。通过本研究,将帮助我们更好地去了解中国PRRSV遗传变异特点,有利于未来疫苗的开发和使用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征
• 1.2 PRRS的流行病学特点及其危害
• 1.3 PRRSV病原特性
• 1.3.1 PRRSV的分类
• 1.3.2 PRRSV的理化特性
• 1.3.3 PRRSV的抗原性
• 1.3.4 PRRSV体外培养及体内组织分布
• 1.3.5 PRRSV致病机理及生物学特性
• 1.4 PRRSV分子生物学研究进展
• 1.4.1 PRRSV基因组结构及功能
• 1.4.2 PRRSV的基因组遗传变异
• 第2章 研究目的及意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 病料、菌株、克隆载体
• 3.1.2 工具酶及主要试剂
• 3.1.3 培养基及抗生素的配制
• 3.1.4 主要缓冲溶液及相关试剂配制
• 3.1.5 感受态细胞制备保存用试剂
• 3.1.6 分子生物学分析软件
• 3.1.7 引物设计与合成
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 样品采集与处理
• 3.2.2 总RNA的提取
• 3.2.3 两步法RT-PCR
• 3.2.4 PCR产物或酶切产物回收与纯化
• 3.2.5 回收后的DNA片度与质粒连接
• 3.2.6 连接产物的转化
• 3.2.7 质粒的小量提取（试剂盒购自全式金公司）
• 3.2.8 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.9 测序
• 第4章 结果与分析
• 4.1 样品的检测
• 4.2 2006年到2010年PRRSV流行状况分析
• 4.3 目的基因扩增、重组质粒构建及鉴定结果
• 2009的发现'>4.4 HUBQJ1-2₂009的发现
• 4.5 NSP2氨基酸序列同源性分析
• 4.6 NSP2氨基酸序列比对分析
• 4.7 NSP2氨基酸序列进化树分析
• 4.8 ORF5推导的氨基酸序列同源性分析
• 4.9 ORF5推导的氨基酸序列比对分析
• 4.10 ORF5推导的氨基酸序列进化树分析
• 4.11 GP5 N-糖基化位点分析
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录