酶法降解琼胶寡糖的制备、分离纯化及生物活性研究

论文摘要

本文对类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）WL菌株进行了10 L罐规模产琼胶酶发酵,并监测发酵过程中发酵液的酶活、菌体浓度、pH的变化。结果表明,经过28 h产酶发酵,最高酶活达到127.3 U/ mL,菌体浓度A620达到0.436（稀释5倍）。10 L罐发酵得到的结果与摇瓶发酵结果基本相同,但发酵时间有所缩短。对琼胶酶水解琼胶制备寡糖的工艺进行了研究,确定的最佳酶解工艺如下：酶解时间为2h,温度为45℃,最适底物为pH 7.0左右的2g/L琼胶水溶液。此工艺条件下制备的琼胶酶解液具有底物利用率较高,还原糖浓度达到147.6 mg/L,转化率为95.8%。对酶解制备的琼胶寡糖采用活性炭吸附提取,并对提取工艺进行研究,研究表明,活性炭对琼胶寡糖最大吸附量在25 mg/g左右,最佳洗脱液为乙醇浓度50%,洗脱液用量为每1g活性炭（湿重）10 mL,洗脱时间为30 min以上,此条件下,寡糖收率为91.6%。此工艺具有操作简单,用时少,寡糖收率高,易于工业化放大等优势。采用多种凝胶层析介质对琼胶寡糖进行分离,结果表明SephadexLH-20分离效果明显优于Sephadex G-10, Sephadex G-15,SephadexG-25,并且介质填充高度越高分离效果越好。另外分离时寡糖上样浓度过高会影响分离效果。最终采用Sephadex LH-20（1.0×100 cm）,寡糖上样浓度为0.5 g/mL,上样量为0.5 mL,洗脱溶剂为水,洗脱流速为40mL/h。获得两种高纯度单一聚合度寡糖样品分别记为寡糖A与寡糖B。采用高效液相色谱检测琼胶寡糖的纯度,对分析检测条件进行选择,在如下HPLC条件下对琼胶寡糖具有良好的分离检测效果,色谱柱：凝胶柱DIOL-150；流动相：水（1.0mL/min）;采用蒸发光散射检测器,条件为：漂移管温度：118℃；载气N2流速：3.2 L/min;检测器灵敏度：1；撞击器：OFF。检测结果表明寡糖A与寡糖B的纯度分别为98.2%与95.4%。采用电喷雾电离质谱（ESI-MS）和13C核磁共振（13C-NMR）对获得的寡糖进行结构测定。结果质谱图非常清晰,裂分归属容易,寡糖A分子量为630,寡糖B的分子量为936,13C-NMR分析表明寡糖A为新琼4糖,寡糖B为新琼6糖。从而表明WL菌株产生的琼胶酶为β-琼胶酶,为琼胶酶的进一步研究奠定了基础。最后对不同乙醇浓度洗脱活性炭制备的琼胶寡糖进行了抗氧化活性的研究比较,结果表明：20%乙醇洗脱组分F2呈现最佳抗氧化活性,半清除率为6 mg/mL。其余组分也有较好的抗氧化活性,40%乙醇洗脱组分F4半清除率为7 mg/mL,10%乙醇洗脱组分F1半清除率为8.2mg/mL,30%乙醇洗脱组分F3半清除率为9.5mg/mL。以还原糖含量计算,新琼六糖对DPPH·清除活性明显优于新琼四糖,新琼六糖和新琼四糖的对DPPH·的半清除率分别为0.75mg/mL和2.50 mg/ mL。初步研究表明琼胶寡糖活性良好适宜于进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 前言
• 第一章 绪论
• 1.1 琼胶
• 1.1.1 琼胶的基本性质
• 1.1.2 琼胶的应用
• 1.2 琼胶寡糖
• 1.2.1 琼胶寡糖的性质
• 1.2.2 琼胶寡糖的生理活性
• 1.3 琼胶寡糖的分离
• 1.3.1 琼胶寡糖乙醇沉淀分离
• 1.3.2 琼胶寡糖活性炭吸附分离
• 1.3.3 琼胶寡糖凝胶层析分离
• 1.3.4 琼胶寡糖高效液相色谱分离
• 1.4 琼胶寡糖的检测与结构分析
• 1.5 本论文研究的目的、意义及主要研究内容
• 第二章 琼胶酶的发酵制备及酶解琼胶的条件研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 WL菌株10L罐发酵制备琼胶酶
• 2.3.2 酶解琼胶制备寡糖的工艺条件研究
• 2.4 小结
• 第三章 活性炭吸附分离琼胶总寡糖工艺研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 TLC分析琼胶寡糖方法的建立
• 3.3.2 活性炭吸附分离琼胶寡糖的工艺的研究
• 3.4 小结
• 第四章 不同聚合度琼胶寡糖的分离
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 适合分离琼胶寡糖的凝胶选择
• 4.3.2 HPLC检测分离所得寡糖纯度方法确定
• 4.4 小结
• 第五章 琼胶寡糖的结构鉴定研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 琼胶寡糖ESI-MS分析
• 13C-NMR分析'>5.3.2 琼胶寡糖¹³C-NMR分析
• 5.4 小结
• 第六章 琼胶寡糖抗氧化活性研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 实验方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 DPPH·清除实验方法的建立
• 6.3.2 微型化DNS法的建立
• 6.3.3 样品DPPH·清除率检测
• 6.3.4 新琼四糖与新琼六糖的抗氧化活性比较
• 6.4 小结
• 结论与展望
• 1. 结论
• 2. 展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间已发表或正在发表的论文和专利