鸡毒霉形体HS株TM-1和mgc3基因的表位预测及原核表达

论文摘要

鸡毒霉形体（Mycoplasma gallisepticum，MG）是鸡慢性呼吸道疾病的病原菌，世界各地均有MG的感染和流行，虽然不直接引起禽的大规模死亡，但疾病的慢性、迁延性流行过程可引起产蛋率下降、孵化率降低、出栏期延长及饲料利用率降低，每年给世界养禽业造成了巨大的经济损失。目前MG的诊断方法主要有病原的分离鉴定、血清平板凝集试验、PCR和EHSA等方法，但上述方法由于耗时或操作复杂或需要昂贵仪器等缺点，难以在基层推广应用，因此MG新型的快速诊断也成为该病急需解决的问题之一。胶体金免疫层析快速检测MG的方法简便、快速、直观，但是研制抗不同抗原表位的单克隆抗体是该方法建立的重要前提。本研究对MG菌体保护性蛋白TM-1和mgc3基因的表达及抗原表位进行了探讨，旨在为ELISA方法、胶体金免疫层析法快速检测方法及基因工程抗原疫苗的研制提供理论依据，主要展开了以下研究。1．鸡毒霉形体保护性抗原基因TM-1和mgc3的克隆参照NCBI收录的TM-1和mgc3基因序列设计引物，以MG基因组为模板，扩增出TM-1和mgc3，经测序，所获得的TM-1基因为819bp；mgc3基因为3186bp。2．TM-1和mgc3基因序列的分析及抗原表位的预测TM-1基因测序结果在NCBI数据库中BLAST比对，与S6株同源性为99％，其中103-134bp和135-166bp为重复序列，抗原表位及二级结构的预测参数综合分析，该重复区具有强抗原表位活性；与R株有两个同源性序列，同源性分别为91％和93％。对mgc3基因的全基因序列BLAST比对，得到三条同源性达99％的序列，此外还有三条序列只与mgc3基因的1-1300bp具有同源性，分别是99％、98％和91％。选取了HS株的mgc3基因1000-3186bp的区域进行抗原表位软件预测，得到1142-1440bp、1704-2169bp、2165-2521bp和2507-2835bp区域具有较强的抗原活性。它们不仅亲水性、表面可及性、抗原性参数较高，而且每段序列的上下游引物都包含了该区的所有突变位点；MG-HS株的mgc3基因中还有10个编码色氨酸TGA的位点。3．鸡毒霉形体TM-1和mgc3基因抗原表位区的原核表达及其活性鉴定将经过分析的含有高免疫活性的目的片段亚克隆到表达载体pGEX-KG，经转化、诱导后获得表达蛋白，SDS-PAGE分析表明融合表达的蛋白分子量分别约为55KDa、37KDa和44 KDa。Western blot印迹证明表达蛋白均具有免疫学活性。说明表达蛋白可用于免疫诊断和也为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 霉形体概述
• 1.2 鸡毒霉形体病的研究
• 1.2.1 病原及发病特点
• 1.2.2 流行病学
• 1.2.3 致病机理
• 1.2.4 免疫机制
• 1.2.5 诊断方法研究
• 1.2.5.1 病原的分离和鉴定
• 1.2.5.2 血清学方法
• 1.2.5.3 分子生物学诊断方法
• 1.2.6 治疗与控制
• 1.3 鸡毒霉形体蛋白分子生物学研究进展
• 1.3.1 鸡毒霉形体结构蛋白的研究
• 1.3.1.1 29KDa蛋白
• 1.3.1.2 MGC3蛋白
• 1.3.1.3 MGC1蛋白
• 1.3.1.4 MGC2蛋白
• 1.3.1.5 PvpA蛋白
• 1.3.1.6 GgpA蛋白
• 1.3.2 鸡毒霉形体血凝素蛋白（pMGA）研究
• 1.3.2.1 pMGA基因家族
• 1.3.2.2 血凝素蛋白
• 1.4 基因应用的研究
• 1.4.1 基因免疫的研究进展
• 1.4.2 基因疫苗的结构
• 1.4.3 鸡毒霉形体基因的研究
• 1.4.3.1 DNA酶切分析
• 1.4.3.2 物理图谱的构建
• 1.4.3.3 DNA指纹分析技术
• 1.4.3.5 rRNA基因的研究
• 1.4.4 抗原表位的研究
• 1.4.4.1 抗原表位研究进展
• 1.4.4.2 抗原表位应用研究
• 2 鸡毒霉形体HS株TM-1基因和mgc3基因表位的原核表达及活性鉴定
• 2.1 研究的目的与意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 主要仪器
• 2.2.1.2 菌株、宿主菌
• 2.2.1.3 载体
• 2.2.1.4 酶、试剂盒及主要试剂
• 2.2.1.5 主要试剂的配制
• 2.2.1.6 生物学软件与相关的生物学网址
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 PCR引物
• 2.2.2.2 MG-HS基因组提取
• 2.2.2.3 PCR扩增与检测
• 2.2.2.4 PCR产物回收
• 2.2.2.5 目的基因的克隆
• 2.2.2.6 TM-1基因、mgc3-1和mgc3-2基因序列预测分析
• 2.2.2.7 mgc3基因的抗原表位mgc3-P1、mgc3-P2、mgc3-P3和mgc3-P4的扩增
• 2.2.2.8 mgc3-P1、mgc3-P2、mgc3-P3和mgc3-P4扩增片段克隆与测序
• 2.2.2.9 重组表达质粒的构建
• 2.2.2.10 诱导表达
• 2.2.2.11 包涵体的纯化
• 2.2.2.12 可溶性蛋白的提取与纯化
• 2.2.2.13 SDS-PAGE电泳
• 2.2.2.14 Western blot
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 TM-1、mgc3基因的克隆测序及序列分析
• 2.3.1.1 TM-1基因的扩增
• 2.3.1.2 mgc3基因的扩增
• 2.3.2 pMD-TM-1、pMD-mgc3-1和pMD-mgc3-2重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.3 TM-1基因和mgc3基因（mgc3-1+mgc3-2）的序列测定分析
• 2.3.3.1 TM-1和mgc3基因测序及序列分析结果
• 2.3.4 氨基酸序列的分析
• 2.3.4.1 跨膜区分析
• 2.3.4.2 DNAStar软件分析MGC3二级结构
• 2.3.5 重组表达质粒pKG-TM-1、pKG-mgc3-P1和pKG-mgc3-P2的构建
• 2.3.5.1 重组表达质粒pKG-TM-1的构建
• 2.3.5.2 重组表达质粒pKG-mgc3-P1和pKG-mgc3-P2的构建
• 2.3.6 保护性抗原和抗原表位的原核表达及Western blot活性鉴定
• 2.3.6.1 保护性抗原基因TM-1的原核表达及免疫活性鉴定
• 2.3.6.2 保护性抗原基因mgc3的抗原表位的表达及免疫活性鉴定
• 3 讨论与结论
• 3.1 讨论
• 3.1.1 鸡毒霉形体HS株保护性抗原TM-1和mgc3基因的克隆
• 3.1.2 鸡毒霉形体HS株保护性抗原TM-1基因序列分析
• 3.1.3 MG-HS株保护性抗原MGC3蛋白表位分析
• 3.2 结论
• 参考文献
• 致谢