里氏木霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中高效表达的研究

论文摘要

木聚糖是半纤维素中含量最丰富的一种组分,在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素,约占细胞干重的35%。它的存在使谷物中的营养物质不能被充分暴露于动物消化液的表面,进而影响动物的消化吸收,降低了饲料的营养价值。木聚糖酶（1,4-β-D-xylan xylanohydrlase,EC 3.2.1.8）通过内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键,水解产物以木寡糖和木二糖为主。随着木聚糖酶在造纸、食品、饲料等领域的成功应用,它已成为酶制剂产业的一个重要产品,在生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业中有着广泛的应用前景,具有很大的商业开发价值。但是目前传统的木聚糖酶生产方法产量较低,限制了其广泛应用,应用基因工程技术可望解决这一问题。本研究以里氏木霉（Trichoderma reesei）QM9414菌株为基因供体,克隆木聚糖酶基因xyn2,分别构建其大肠杆菌表达载体和酵母表达载体,并分别转到大肠杆菌和毕赤酵母中。进一步对表达的木聚糖酶进行酶学分析,为大规模工业生产和应用奠定基础。主要研究结果如下:以木聚糖为诱导剂诱导里氏木霉表达木聚糖酶,确定了最佳诱导时间为72小时,标准状态下最大酶活为6.32IU/ml。里氏木霉木聚糖酶最适pH值为4.0,最适温度为50℃。采用RT-PCR方法克隆到了里氏木霉木聚糖酶基因xyn2。测序得到xyn2基因的序列与GeneBank上编号为U24191的xyn2基因序列完全相同。采用PCR法,以里氏木霉DNA为模板克隆了里氏木霉木聚糖酶基因。测序得到xyn2基因的DNA序列,与xyn2基因的cDNA序列进行了比对,确定了xyn2基因含有一个内含子。构建了xyn2基因的大肠杆菌表达载体pEK1。将pEK1转化至大肠杆菌BL21中,进行诱导表达。IPTG诱导5小时,标准状态下最大酶活为42.28IU/ml。对表达的木聚糖酶性质进行了分析,确定最适pH值为6.5,最适温度为45℃。构建了xyn2基因毕赤酵母表达载体pPIC9-xyn2。摇瓶培养96h标准状态下最大酶活为208.12IU/ml,比出发菌株酶活提高了约33倍。对重组木聚糖酶性质进行了分析,确定最适pH值为5.0,最适温度为55℃。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 研究目的及意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 木聚糖酶的研究进展
• 1.2.2 毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.3 本论文的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种及载体
• 2.1.2 试剂及酶类
• 2.1.3 常用试剂的配制
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 里氏木霉的培养
• 2.2.2 里氏木霉RNA的提取
• 2.2.3 RNA的反转录
• 2.2.4 里氏木霉DNA的提取
• 2.2.5 木聚糖酶基因的克隆
• 2.2.6 Xyn2基因cDNA和DNA序列的比对
• 2.2.7 大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2.8 Xyn2原核表达产物分析
• 2.2.9 原核表达产物的检测
• 2.2.10 毕赤酵母表达载体的构建
• 2.2.11 毕赤酵母的电转化
• 2.2.12 重组酵母的表达
• 2.2.13 表达产物的酶学性质分析
• 2.2.14 重组表达木聚糖酶酶解产物分析
• 3 结果与分析
• 3.1 里氏木霉的培养
• 3.1.1 木糖标准曲线的绘制
• 3.1.2 里氏木霉木聚糖酶诱导时间的确定
• 3.1.3 温度和pH值对里氏木霉木聚糖酶酶活的影响
• 3.2 木聚糖酶基因的克隆
• 3.2.1 里氏木霉RNA的提取
• 3.2.2 毕赤酵母表达用xyn2基因的克隆
• 3.2.3 原核表达用xyn2基因的克隆
• 3.2.4 基因组DNA中xyn2基因的克隆
• 3.2.5 xyn2基因DNA序列与cDNA序列的比对
• 3.3 原核表达载体的构建
• 3.3.1 原核表达载体pEK1的构建
• 3.3.2 重组菌株BLK1的诱导表达
• 3.3.3 温度和pH值对重组菌株BLK1木聚糖酶活力的影响
• 3.4 毕赤酵母表达载体的构建
• 3.4.1 表达载体pPIC9多克隆位点的还原
• 3.4.2 表达载体pPIC9Z的构建
• 3.4.3 酵母表达载体的构建
• 3.4.4 毕赤酵母的转化
• 3.4.5 重组菌株的表达
• 3.4.6 重组菌株酶活以及最适pH值和温度的测定
• 4 讨论
• 4.1 基因供体的选择
• 4.2 基因表达系统的选择
• 4.2.1 原核表达系统
• 4.2.2 真核表达系统
• 4.3 里氏木霉的培养
• 4.4 木聚糖酶基因的克隆
• 4.4.1 里氏木霉RNA的提取
• 4.4.2 引物的设计
• 4.4.3 Taq酶的选择
• 4.4.4 PCR反应条件的确定
• 4.5 毕赤酵母的转化
• 4.6 酵母转化子的直接PCR检测
• 4.7 不同表达系统对重组木聚糖酶性质的影响
• 5 结论
• 5.1 里氏木霉的培养
• 5.2 木聚糖酶基因的克隆
• 5.3 里氏木霉木聚糖酶基因内含子的比对
• 5.4 原核表达载体的构建
• 5.5 xyn2基因在大肠杆菌中的表达
• 5.6 真核表达载体的构建
• 5.7 xyn2基因在毕赤酵母的表达
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文