氨基转移酶基因（eR基因）的克隆及在黄瓜中的遗传转化

论文摘要

由假古巴霜霉菌（Pseduoperonospora cubensis）引起的霜霉病是世界范围内的瓜类作物的灾害性病害。黄瓜（Cucumis stativus L.）上尤为严重，无论是保护地还是露地条件下栽培的黄瓜，发病普遍而且危害严重。利用DNA重组技术可使性状在种间转移，且受体本身主要性状不被改变，突破了远缘杂交不亲合障碍，开辟了植物育种的新途径。本试验以黄瓜、甜瓜为试材，克隆了两个eR基因，H-At2、T-At2，其中H-At2基因为首次在黄瓜中克隆，并得到编码区序列。申请了GENBANK号，分别为EF628204、EF628205。同时也克隆了黄瓜、甜瓜基因组中的At2基因，记为H’-At2、T’-At2，也申请了GENBANK号，分别为EF628206、EF628207。将H-At2、T-At2这两个基因转化到黄瓜中，期望提高黄瓜对霜霉病的抗性，获得有育种价值的黄瓜种质资源。通过提高寄主酶促活性来提高抗病性的基因，被叫做酶促抗性基因（enzymatic resistance）简称eR基因。At1、At2是编码光呼吸乙醛酸循环过氧化氢酶系中的氨基转移酶的两个基因，最近的研究表明将两个基因转化到感性甜瓜品系表现出对霜霉病高抗病性。本试验在此基础上以黄瓜、甜瓜为试材，采用RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）方法从cDNA中克隆了eR基因—氨基转移酶基因（At2）；构建了由光合启动子PNZIP调控的At2基因的植物表达载体（PPN-At2）和植物通用表达载体PPN；利用花粉管通道技术将其导入黄瓜优良自交系中。获得了转PPN-at2 PCR阳性植株。主要研究结果如下：1．本实验重点进行了氨基转移酶基因（At2基因）的克隆及其表达载体的构建。根据甜瓜At2基因序列设计引物，从抗病黄瓜、甜瓜叶片的总RNA中，利用RT-PCR技术扩增出H-At2、T-At2编码区基因片段，克隆到PGEM-T easy载体中，经测序发现与已知的抗性At2序列具有很高的同源性。2．构建了由PNZIP的启动子调控的通用植物表达载体（PPN）及其At2基因的植物表达载体（PPN-At2）。用ScaⅠ／ScaⅡ从重组质粒中切出H-At2、T-At2基因片段，插入到PNZIP的启动子之后，获得了工程菌株，并命名为PPN-at2。3．利用花粉管通道技术对上述基因进行了黄瓜的遗传转化实验。将PPN-At2导入黄瓜优良自交系中，在经卡那霉素（KN）抗性初步筛选基础上，对抗性苗进行了PCR技术扩增，获得了5株转基因植株。其转化率在万分之二三左右。这种利用花粉管通道技术转化率为黄瓜的遗传转化拓宽了转化途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一部分 文献综述
• 1 目的和意义
• 2.生物技术在黄瓜育种中应用及黄瓜霜霉病的研究现状
• 2.1 分子标记技术
• 2.1.1 黄瓜基因的分子标记
• 2 1.2 黄瓜遗传图谱的构建
• 2.1.3 黄瓜组织培养技术
• 2.1.4 黄瓜基因的克隆与表达
• 2.2 遗传转化体系建立及基因工程改良
• 2.3 黄瓜霜霉病的研究现状
• 2.3.1 黄瓜霜霉病的抗性遗传研究
• 2.3.2 黄瓜抗病害基因工程育种的应用前景
• 3.eR基因—氨基转移酶基因
• 4.光特异性表达启动子PNZIP调控的植物高效表达载体
• 4.1 组成型启动子
• 4.2 组织特异性启动子
• 5 本试验的主要研究内容
• 第二部分 研究工作
• 一.材料与方法
• 1.试验材料与地点
• 1.1 试剂
• 1.2 载体与菌株
• 1.3 植物材料
• 1.4 软件工具
• 1.5 试验地点
• 1.6 培养基和常用溶液
• 2.常规方法
• 2.1 基因组DNA、质粒DNA、RNA的提取方法
• 2.1.1 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 2.1.2 CTAB法提取转基因植株叶片DNA
• 2.1.3 TRIOL法提取叶片总RNA
• 2.2 DNA重组过程所涉及的实验方法
• 2.2.1 限制性内切酶酶切质粒
• 2.2.2 DNA粘性末端的平滑化
• 2.2.3 载体大片段5’端脱磷
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳及目的片段的回收
• 2.2.5 载体片段和目的片段的连接
• 2法制备E.coli感受态细胞'>2.2.6 CaCl₂法制备E.coli感受态细胞
• 2.2.7 热击法转化E.coli DH10B
• 3.氨基转移酶基因At2的克隆及表达载体构建
• 3.1 At2基因的克隆
• 3.2 PNZIP启动子的克隆和通用植物表达载体PPN的构建
• 3.2.1 PNZIP启动子的克隆
• 3.2.2 PPN植物通用表达载体构建
• 4 氨基转移酶At2基因表达载体PPN-At2的构建
• 5.At2基因对黄瓜遗传转化及转基因植株检测
• 5.1 花粉管通道技术将基因导入黄瓜
• 0代黄瓜植株的抗性筛选与分子检测'>5.2 转At2基因T₀代黄瓜植株的抗性筛选与分子检测
• 二.结果与分析
• 1.At2基因的克隆
• 1.1 RT-PCR扩增At2基因
• 1.2 目的片段与T载体连接及重组子鉴定
• 1.3 测序结果
• 2.PNZIP启动子的克隆与表达载体的构建
• 2.1 PCR扩增PNZIP启动子
• 2.2 目的片段与T载体连接及重组子鉴定
• 2.3 测序结果
• 2.4 PPN表达载体构建及检测
• 2.5 PPN-At2表达载体构建及检测
• 3.黄瓜的遗传转化
• 3.1 At2基因转入黄瓜及KN霉素抗性筛选
• 0代PCR检测'>3.2 At2基因转化黄瓜T₀代PCR检测
• 4 小结
• 三.讨论
• 1.关于氨基转移酶基因
• 2.关于植物高效表达载体
• 2.1 植物高效表达载体的构建
• 2.2 关于提高目的基因与载体过程中连接效率的措施
• 3.关于抗性选择标记
• 4 关于黄瓜的遗传转化
• 附表1 黄瓜、甜瓜基因组At2基因的克隆
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历