论文摘要
灰飞虱（Laodelphax striatellus（Fallen））是一种重要的多食性害虫,在我国北方以4龄和5龄若虫越冬;在福建、广东一带无越冬现象,可以常年发生;生产上主要依靠化学防治。近年来,该虫在我国许多地区特别是江苏省频繁爆发,且绝大多数常规药剂已不能有效控制其危害,因此,给农业生产造成了巨大损失。为了弄清灰飞虱的抗药性现状和抗药性机理,建立有效的抗药性治理措施,提高现有的农药品种的防治效果,本文以筛选获得的灰飞虱抗性品系和敏感品系及田间抗性品系为材料,详细研究了灰飞虱抗性现状、交互抗性及生化机理、抗性现实遗传力、抗性适合度、抗药性生化与分子生物学机理,取得了多项具有重要理论和实践意义的成果。一、灰飞虱田间种群对常规杀虫剂的抗药性监测及其抗性机制分析本文对我国6个省市的8个灰飞虱田间种群进行了杀虫剂抗药性监测,监测结果表明,采集于江苏的3个种群抗性倍数最高,对吡虫啉表现高抗水平,对毒死蜱,乙酰甲胺磷和溴氰菊酯表现出中等抗性（抗性倍数分别为:66-108,31-50,17-24和12-21）。来自福建与广东的种群对吡虫啉,毒死蜱和乙酰甲胺磷表现出中等水平抗性（抗性倍数分别为:27-29,10-12,和9-13）。然而,来自山东与云南的灰飞虱种群对所有的供试杀虫剂均表现为较低抗性水平（抗性倍数＜6）。采自北京的种群对杀虫剂的敏感性最高,与前人报道的敏感基线接近。除江苏种群对氟虫腈和丁硫克百威的敏感性下降外（抗性倍数为5-8）,其它供试虫群均对氟虫腈和丁硫克百威表现较高的敏感性。生化测定证实,细胞色素P450单加氧酶与酯酶活力的提高与灰飞虱对杀虫剂的抗药性呈显著正相关,乙酰胆碱酯酶的不敏感性也参与导致了灰飞虱多重抗性的发生。二、灰飞虱敏感品系和抗性品系的室内选育在室内对采集于北京和建湖的田间灰飞虱种群进行敏感性恢复选育,未接触任何药剂的情况下饲养12代,北京敏感品系对吡虫啉、氟虫腈、溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷和丁硫克百威的LD50值分别由0.740,0.100,0.970,1.75,2.08,1.34ng/头下降为0.505,0.0448,0.700,1.12,0.836和0.601 ng/头,对供试杀虫剂的敏感性均有所增强;高抗的建湖灰飞虱田间种群在失去杀虫剂的选择压力12代后,对吡虫啉,氟虫腈,溴氰菊酯,毒死蜱、乙酰甲胺磷和丁硫克百威的抗性水平分别由108,6.90,21.0,34,24和6倍下降到10.4,1.54,2.34,2.07,4.16和1.04倍,除对吡虫啉的高水平抗性外,中低水平抗性几乎都恢复到敏感水平。而用吡虫啉,氟虫腈,毒死蜱和丁硫克百威分别对建湖品系进行连续12代抗性筛选后,抗性灰飞虱对这4种杀虫剂的抗性则分别由108倍、6.9倍、34倍、5.97倍,上升到281倍、33.1倍、283倍和52.2倍;其中在筛选的前5代抗性上升较慢,在后几代抗性很快上升。由此认为,灰飞虱对吡虫啉和毒死蜱极易产生高水平抗性,对丁硫克百威和氟虫腈的抗性发展较慢,且停止用药可以使其敏感性明显下降,有可能回复到原来的敏感性水平。三、灰飞虱对毒死蜱的抗性机理及其交互抗性风险研究以敏感品系为对照,测定了毒死蜱室内筛选前后灰飞虱对不同药剂的抗性,结果表明,毒死蜱室内筛选11代不仅使毒死蜱的抗性倍数升高了5.35倍,同时使乙酰甲胺磷和丁硫克百威的抗性也分别增加了1.64和1.39倍,但氟虫腈、溴氰菊酯和吡虫啉的抗性倍数经过筛选却分别变为起始品系的0.708,0.679和0.304倍。由此认为,毒死蜱与乙酰甲胺磷、丁硫克百威有明显的正交互抗性,而与氟虫腈、溴氰菊酯和吡虫啉没有正交互抗性。增效剂增效实验结果显示,在敏感品系中,PBO和TPP对毒死蜱的增效比分别为3.04和2.91倍,在抗性品系中,其增效比则分别高达6.65倍和12.0倍。解毒酶活力测定结果表明,灰飞虱抗性品系的多功能氧化酶（MFO）和酯酶（EST）活力分别是田间起始品系的3.21和7.94倍,而谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活力没有显著差异。同时,测定灰飞虱抗感品系乙酰胆碱酯酶（AChE）的动力学参数和敏感性发现,抗性品系AChE的Km值显著的高于敏感品系（比值为2.74）,Vmax值也较敏感品系的显著增大（比值为1.24）,用氧化型毒死蜱作为抑制剂时,I50也增加了8.3倍,双分子速率常数（Ki）下降了2.26倍。由此认为,灰飞虱对毒死蜱的抗药性机理涉及MFO和EST解毒代谢的加强以及靶标AChE的不敏感性。四、灰飞虱对吡虫啉的抗性机理及其交互抗性风险研究以敏感品系为对照,测定了吡虫啉室内筛选前后灰飞虱对不同药剂的抗性,结果表明,吡虫啉室内筛选11代,除了使吡虫啉的抗性升高1.78倍外,并没有其他被试药剂的抗性升高。其中丁硫克百威的抗性没有明显变化（1.06倍）,溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷和氟虫腈的抗性倍数分别减少为起始品系的0.821,0.786,0.471和0.312倍。由此认为,吡虫啉与丁硫克百威、溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷和氟虫腈均没有正交互抗性。至于和氟虫腈及乙酰甲胺磷等抗性下降显著的药剂之间是否存在负交互抗性,尚需要进一步研究。解毒酶活力测定结果表明,吡虫啉抗性品系的多功能氧化酶（MFO）和酯酶（EST）活力分别是田间起始品系的3.05和7.81倍,而谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活力没有显著差异。由此认为,灰飞虱对吡虫啉的抗药性机理至少涉及到MFO和EST解毒代谢的加强。五、灰飞虱对丁硫克百威的抗性机理及其交互抗性风险研究以敏感品系为对照,测定了丁硫克百威室内筛选前后灰飞虱对不同药剂的抗性,结果表明,丁硫克百威室内筛选11代使丁硫克百威的抗性升高了4.49倍,但对溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷、吡虫啉,和氟虫腈的抗性倍数分别有较大程度的下降,分别变为起始品系的0.426,0.316,0.248,0.153和0.105倍。由此认为,丁硫克百威与溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷、吡虫啉,和氟虫腈没有正交互抗性。解毒酶活力测定结果表明,丁硫克百威抗性品系的多功能氧化酶（MFO）和酯酶（EST）活力分别是田间起始品系的2.21和1.92倍,而谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活力没有显著差异。同时,测定灰飞虱抗感品系乙酰胆碱酯酶（AChE）的敏感性发现,用乙酰甲胺磷、丁硫克百威和氧化毒死蜱作为抑制剂时,敏感品系双分子速率常数（Ki）分别是抗性品系的4.98、4.39和3.11倍。由此认为,灰飞虱对丁硫克百威的抗药性机理涉及MFO和EST解毒代谢的加强以及靶标AChE的不敏感性。六、灰飞虱敏感性恢复及杀虫剂之间的交互作用本研究通过比较室内筛选和室内敏感性恢复饲养品系的抗药性动态,发现田间抗性品系经过室内敏感性恢复饲养后,对所有被试药剂的抗性均大幅度下降;而用吡虫啉、毒死蜱和丁硫克百威进行抗性筛选的3个处理,所获得的抗性品系对不同药剂的交互抗性各有差异,其中丁硫克百威筛选的CAR-R品系除了对丁硫克百成的抗性呈正增长外,对其它5种药剂均呈负增长;毒死蜱筛选的CHL-R品系对毒死蜱、丁硫克百威、乙酰甲胺磷、氟虫腈和溴氰菊酯的抗性倍数均呈正增长,只有对吡虫啉的抗性呈现了少量的负增长;同样,吡虫啉筛选的IMI-R品系对吡虫啉、丁硫克百威、毒死蜱和溴氰菊酯的抗药性呈现正增长,仅对氟虫腈的抗性略有下降;值得注意的是,本研究发现所有经药剂处理的品系,对任何药剂的抗性下降幅度均小于不接触药剂的恢复饲养品系。这表明特定的药剂处理,虽然不一定对所有药剂均产生交互抗性,但确实可以阻止不同药剂的敏感性恢复。进一步的生化机理研究表明,不同药剂处理均能使灰飞虱维持高水平的解毒代谢酶活力,讨论认为这可能就是药剂处理延缓灰飞虱对不同杀虫剂敏感性恢复的机理。七、灰飞虱种群的抗性遗传力与抗性适合度研究在室内利用对吡虫啉,毒死蜱,丁硫克百威产生抗性的3个灰飞虱品系IMI-R、CHL-R和CAR-R进行了抗性遗传力、生物适合度研究。结果表明,灰飞虱对3种药剂的抗性现实遗传力从大到小依次为:毒死蜱（h2=0.173）＞丁硫克百威（h2=0.127）＞吡虫啉（h2=0.108）,灰飞虱的抗性发展速率随药剂杀死率的提高而加快,在假设的条件下,药剂杀死率均为70%～80%时,预计抗性增长10倍时,毒死蜱可使用20～25代、丁硫克百威可使用28～34代,吡虫啉可使用33～40代。这表明灰飞虱对以上3种杀虫剂均存在抗性风险,且毒死蜱的抗性风险略高于丁硫克百威和于吡虫啉。适合度研究表明,3个抗性品系的适合度显著地低于敏感品系,毒死蜱、吡虫啉和丁硫克百威抗性品系的适合度分别是敏感品系的0.372、0.325和0.434倍。由此可见,灰飞虱对吡虫啉、毒死蜱和丁硫克百威产生抗性后,其适合度均显著下降。加之灰飞虱的抗性遗传力较低,故本研究认为,通过适当的治理,可以有效延缓甚至阻止灰飞虱的抗药性发展。八、灰飞虱杀虫剂靶标基因的克隆和序列分析利用简并引物,采用半巢式PCR等分子生物学技术,对灰飞虱烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）α亚基的cDNA片段进行克隆,并对序列进行分析。测序结果显示,扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的4种亚型（分别命名为Lsα1、Lsα2、Lsα3、Lsα4）,都具有典型的α亚基的结构:2个相邻的半胱氨酸,由2个半胱氨酸之间二硫键形成包含15个氨基酸的胞外环,与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基。克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达65%～99%的同源性,表明克隆的cDNA片段是灰飞虱nAChRα亚基基因的部分序列。采用相同的方法,对灰飞虱乙酰胆碱酯酶的cDNA片段进行了克隆和序列分析。测序结果显示,成功地从灰飞虱L.striatellus中克隆出两种AChE基因的cDNA片段,并命名为Ls.ace1、Ls.ace2。序列比对及同源性分析表明,Ls.ace1与其它昆虫Ⅰ型AChE基因（ace1）序列相同区域相似性在90%以上,Ls.ace2与它昆虫Ⅱ型AChE（ace2）基因序列相同区域相似性在80%以上,而Ls.ace1和Ls.ace2的同源性为55%,说明灰飞虱体内存在两种AChE基因。