β-catenin抗氧化应激所致人皮肤成纤维细胞衰老的机制研究

论文摘要

皮肤细胞的内源性衰老和外源性衰老有着共同的分子机制,即均遭受ROS所致的氧化应激,并发生一系列后续效应,共同影响着皮肤细胞乃至皮肤的衰老。因此,寻找皮肤衰老相关的重要靶分子,有效控制氧化应激延缓皮肤细胞衰老,是皮肤美容科最紧迫的使命。β-catenin是转录因子共激活剂,它在调控细胞增殖、分化、凋亡和衰老方面有着非常重要的作用。然而,β-catenin的活化在影响人皮肤成纤维细胞的寿命方面我们知之甚少。本课题为了阐明β-catenin调控皮肤衰老的可能的作用机制,我们在NHSFs中转染pcDNA3.1-β-catenin,然后用H2O2处理诱导人皮肤成纤维细胞衰老。我们发现在该衰老模型中β-catenin的mRNA和蛋白的表达上调了,并且延缓了许多衰老表型,如：改变了细胞的形态,细胞凋亡,衰老相关的p-半乳糖苷酶以及细胞活性氧,超氧化物歧化酶的活性,同时上调了抗衰老相关基因FoxO3a,SMP30和Tbx3的表达,以及下调了致衰老标志性基因p16INK4a的转录。本课题试图从基因水平来阐明β-catenin调控人皮肤成纤维细胞衰老的可能的作用机制,并努力寻找皮肤衰老相关的重要靶分子,为未来开发抗皮肤衰老的药物寻找可能的作用靶点。第一章氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老中β-catenin的表达研究目的：观察β-catenin在氧化应激（hydrogen peroxide, H2O2）所致的人皮肤成纤维细胞衰老中的变化,探讨其在应激诱导的皮肤衰老中可能的作用。方法：从儿童包皮分离培养原代成纤维细胞,H2O2处理第2～4代人皮肤成纤维细胞,显微镜观察其形态学改变,衰老相关的β-半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒（senescence-associatedβ-galactosidase, SA-β-gal）检测,RT-PCR、Western blot检测β-catenin mRNA和蛋白表达水平。结果：150μmol/L H2O2处理2h后可以诱导正常人皮肤成纤维细胞（normal human skin fibroblasts, NHSFs）衰老。在衰老细胞（NHSFs+ H2O2）中SA-β-gal阳性率达到约（37.67±1.53）%,而正常人皮肤成纤维细胞（normal human skin fibroblasts, NHSFs）组中SA-β-gal阳性率只有（2.97±0.25）%,两组比较有显著性差异（p=0.000< 0.01）。RT-PCR的结果显示,在NHSFs组中β-catenin/GAPDH mRNA比值为0.59±0.04, NHSFs+H2O2组中β-catenin/GAPDH mRNA比值为0.29±0.30, NHSFs组β-catenin/GAPDH mRNA比值明显高于NHSFs+H2O2组,两组比较具有显著性差异（t=10.062,p=0.001< 0.01）。Western blot结果显示,NHSFs组β-catenin/GAPDH蛋白比值为0.62±0.03, NHSFs+H2O2组β-catenin/GAPDH蛋白比值为0.31±0.01。NHSFs组β-catenin/GAPDH蛋白比值明显高于NHSFs+ H2O2组,两组比较具有显著性差异（t=14.971,p=0.000<0.01）。结论：150μmol/L H2O2处理2h可以诱导人皮肤成纤维细胞发生衰老改变,应激诱导的衰老细胞中P-catenin表达水平明显降低,我们初步推测P-catenin可能是调控皮肤衰老的重要的靶基因,这将为研究抗皮肤衰老提供新的思路和线索。第二章高表达的P-catenin延缓氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老相关表型的研究目的：观察氧化应激（hydrogen peroxide, H2O2）所致的人皮肤成纤维细胞衰老表型的变化,以及高表达的β-catenin对衰老表型的影响。方法：我们先在NHSFs中转染pcDNA3.1-β-catenin,然后通过H202处理转染细胞来诱导细胞衰老模型。研究高表达的β-catenin对细胞形态,细胞凋亡,衰老相关的p-半乳糖苷酶以及细胞活性氧,超氧化物歧化酶的活性的影响。结果：高表达的β-catenin延缓了许多衰老表型,包括：改变了细胞的形态,细胞凋亡,衰老相关的p-半乳糖苷酶以及细胞活性氧,超氧化物歧化酶的活性。结论：我们的数据表明了β-catenin转录因子延缓了人皮肤成纤维细胞衰老,推测β-catenin在调控人皮肤成纤维细胞的长寿方面有着重要的作用。第三章β-catenin对氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老的保护机制研究目的：观察高表达的β-catenin对氧化应激（hydrogen peroxide,H2O2）所致的人皮肤成纤维细胞衰老模型中衰老靶基因FoxO3a, SMP30, Tbx3和p16INK4a表达的影响。方法：我们先在NHSFs中转染pcDNA3.1-β-catenin,然后通过H2O2处理转染细胞来诱导细胞衰老模型。研究高表达的β-catenin对衰老相关基因FoxO3a, SMP30, Tbx3和p16INK4a表达的影响。结果：高表达的β-catenin激活了FoxO3a, SMP30, Tbx3基因的表达,而抑制了p16INK4a基因的转录。结论：我们的数据证明了β-catenin具有一个重要的调控H202诱导的人皮肤成纤维细胞衰老的作用,该作用可能是通过激活FoxO3a,SMP30和bx3的活性,或是抑制p16INK4a的转录来实现的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文主要英汉缩略语名词对照表
• 技术路线
• 前言
• 第一章 氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老中β-catenin的表达研究
• 1.1 引言
• 1.2 实验材料
• 1.3 实验方法
• 1.4 结果
• 1.5 讨论
• 1.6 结论
• 第二章 高表达的β-catenin延缓氧化应激所致人皮肤成纤维细胞衰老相关表型的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞复苏
• 2.3.2 感受态的制备
• 2.3.3 含抗生素平板的制备
• 2.3.4 质粒转化感受态细胞DH5α
• 2.3.5 质粒的抽提以及鉴定
• 2.3.6 质粒浓度和纯度的测定
• 2.3.7 pcDNA3.1-β-catenin质粒图谱
• 2.3.8 质粒转染
• 2O₂处理转染前后的人皮肤成纤维细胞'>2.3.9 H₂O₂处理转染前后的人皮肤成纤维细胞
• 2.3.10 细胞增殖能力测定（MTT法）
• 2.3.11 SA-β-gal活性测定
• 2.3.12 RT-PCR钡组定人皮肤成纤维细胞中β-catenin mRNA的表达
• 2.3.13 Western-blot测定人皮肤成纤维细胞中β-catenin蛋白的表达
• 2.3.14 Annexin V-FITC细胞凋亡的检测
• 2.3.15 巧细胞内活性氧（ROS）活性的检测
• 2.3.16 细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性的检测
• 2.3.17 统计分析
• 2.4 实验结果
• 2.5 讨论
• 2.6 结论
• 第三章 β-catenin对氧化应激所致人皮肤成纤维细胞衰老的保护机制研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.4 实验结果
• 3.5 讨论
• 3.6 结论
• 总结论
• 研究展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间主要成果和奖励