水稻螟虫嗅觉相关蛋白基因的克隆、表达及功能分析

论文摘要

二化螟Chilo suppressalis（Walker）,属鳞翅目螟蛾科,是我国水稻上一种重要的害虫。昆虫嗅觉在感受气味物质、寻找寄主、交配等方面起着重要的作用。在对二化螟触角感器有一定了解的基础上,有必要对其嗅觉识别的分子机制进行研究,阐明嗅觉反应的本质原因,找到新的作用靶标,为筛选、研究安全高效的引诱剂、趋避剂等提供帮助;同时昆虫作为良好的模式生物,对其嗅觉的研究能够有助于深入研究人类嗅觉的本质。本研究通过RT-PCR、RACE克隆得到了嗅觉相关的蛋白基因,原核系统表达纯化了蛋白、并对蛋白的功能进行了研究。获得的主要结果如下:1.利用RT-PCR和RACE方法得到了鳞翅目螟蛾科昆虫二化螟gobp2全长基因。该基因最大编码框为489个核苷酸,编码162个氨基酸残基,预测的分子量为18.192kDa,等电点为5.08,前21个编码氨基酸为信号肽序列,具有气味结合蛋白的典型特征。成功构建了CsupGOBP2的原核表达载体pET30a/CsupGOBP2,并在大肠杆菌中成功表达,经过亲和层析和凝胶过滤获得高纯度的蛋白,免疫家兔制备了多克隆抗体。通过RT-PCR和Western blot方法对二化螟gobp2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达谱进行了分析,结果表明GOBP2在二化螟雌雄虫触角中都表达且表达量相同。以（N-phenyl-l-naphthylamine）1-NPN为荧光探针,利用荧光结合实验方法对纯化蛋白的功能进行了分析,结果表明1-NPN结合在蛋白结构的内部,来自水稻挥发物和性信息素成分的各种气味分子对1-NPN/GOBP2复合物中的1-NPN有不同的竞争能力,cls-11-hexadecenal和Laurinaldehyd两种醛类物质对1-NPN竞争能力最强,表明在所检测的17种物质中这两种物质对GOBP2结合能力最强。2.应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中在昆虫细胞Tn中表达了二化螟GOBP2蛋白,用His-Tag单抗及兔多克隆抗体进行Western blot分析结果证实表达的蛋白为His与GOBP2的融合蛋白。3.克隆了大螟、稻纵卷叶螟gobp2基因部分cDNA序列,对CsupGOBP2、SinfGOBP2、CmedGOBP2的序列分析结果表明该基因在一定程度上反映了鳞翅目昆虫亲缘关系的远近,与形态上的分科结果是一致的。4.利用RT-PCR和RACE技术克隆了二化螟gobpl基因全长序列,该基因最大编码框为522个核苷酸,编码173个氨基酸残基,预测的分子量为20.039kDa,等电点为4.84。推断的信号肽为前22个氨基酸。对3’末端的扩增首次发现该基因的3’UTR可能存在长度不同的转录本;成功构建了该基因的原核表达载体pET30a/CsupGOBP1,制备了兔多克隆抗体,利用荧光结合实验对该蛋白对不同气味分子的检测结果表明所检测的气味分子对荧光探针1-NPN的竞争能力都很弱,说明对蛋白的结合能力较弱。5.利用RT-PCR和RACE方法成功克隆了二化螟pbp2基因全长cDNA序列,并对基因组序列进行了扩增。该基因最大编码框为498个核苷酸,编码165个氨基酸残基,预测的分子量为18.554 kDa,等电点为4.71。PBP2序列片段经Signal3.0分析表明该蛋白推断的信号肽及最大可能的切割位点为前21个氨基酸。对pbp2基因组的分析表明该基因具有相同的3个外显子-2个内含子结构,仅在长度上存在较大差异。外显子1和外显子2在昆虫PBP基因进化中大小一致,而外显子3则变异较大。同时内含子的插入位点在该基因中也是很保守的,第1、2个内含子分别在编码蛋白的Glu22、Ala82（Ala81）位氨基酸之后插入,但插入的内含子的长度变异较大（76bp-437 bp、104 bp-1251 bp）。构建了pET30a/CsupPBP2原核表达载体,割胶回收的蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,对纯化的蛋白利用内源荧光的变化对二化螟三种信息素成分Z11-16:Ald、Z9:16:Ald、Z13-18:Ald的测定结果表明Z11-16:Ald对蛋白内源荧光有明显的淬灭作用,而Z9:16:Ald、Z13-18:Ald对荧光的淬灭作用不大.6.通过已报道的其它昆虫的基因序列信息设计兼并引物扩增了二化螟、大螟的OR受体基因,结果表明二化螟、大螟中有该受体基因的表达,与鳞翅目其它种昆虫序列相似性很高,在整个昆虫种群中高度保守。在原核系统中的表达没有成功。7.构建了二化螟触角cDNA文库,酶切鉴定及通过PCR方法从文库中筛选CsupGOBP1、CsupGPBP2、CsupPBP2基因的结果显示构建的文库质量较好,满足筛选相关基因的要求。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
• 1 信息化合物
• 1.1 昆虫性信息素的性质与作用
• 1.2 植物挥发性化合物的性质与作用
• 2 昆虫的化学感受器
• 3.昆虫嗅觉相关蛋白的研究进展
• 3.1 气味物质的分子结构
• 3.2 气味结合蛋白的分子结构
• 3.3 气味结合蛋白在触角中的分布
• 3.4 气味结合蛋白的生化特性
• 3.5 气味结合蛋白的表达时间及其代谢
• 3.6 气味结合蛋白的配体结合实验
• 3.7 气味结合蛋白的生理功能
• 3.8 气味结合蛋白的研究方法
• 3.9 昆虫嗅觉受体的蛋白结构
• 3.10 昆虫嗅觉受体的功能
• 4 水稻鳞翅目害虫的重要性及其控制新途径思考
• 5 本研究的背景
• 6 本研究的目的与意义
• 第2章 二化螟普通气味结合蛋白2基因克隆、表达及功能分析
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 二化螟触角gobp2基因的克隆及序列分析
• 1.3.1 昆虫触角总RNA的提取
• 1.3.2 甲醛变性电泳的检测
• 1.3.3 提取的总RNA浓度及纯度的测定
• 1.3.4 PCR引物的设计及合成
• 1.3.5 cDNA第一链、第二链合成
• 1.3.6 二化螟gobp2基因片段的RACE扩增
• 1.3.7 PCR产物的纯化及克隆
• 1.3.8 感受态细胞的制备（CaCl2法）
• 1.3.9 连接载体的转化
• 1.3.10 二化螟gobp2基因全长的扩增
• 1.3.11 二化螟gobp2基因序列特征分析
• 1.4 二化螟触角gobp2基因的表达
• 1.4.1 二化螟gobp2基因原核表达载体的构建
• 1.4.2 融合蛋白的表达
• 1.4.3 SDS-PAGE电泳分析
• 1.4.4 Western Blot
• 1.5 二化螟触角gobp2基因表达蛋白的纯化及特性分析
• 1.5.1 菌液的培养及菌体的处理
• 1.5.2 镍螯合琼脂糖凝胶色谱分离His标签重组蛋白包涵体
• 1.5.3 以纯化的目的蛋白为抗原制备多克隆抗体
• 1.5.4 多克隆抗体的纯化
• 1.6.二化螟触角gobp2基因表达蛋白的特性分析
• 1.6.1 半定量RT-PCR
• 1.6.2 二化螟不同组织SDS-PAGE电泳及Western Blot分析
• 1.6.3 荧光测定
• 1.6.4 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 二化螟触角总RNA的提取
• 2.2 二化螟gobp2基因5'RACE扩增扩增及序列测定
• 2.3 二化螟触角gobp2基因全长序列的扩增及序列分析
• 2.4 二化螟触角gobp2基因原核表达载体的构建
• 2.5 融合蛋白的表达、纯化、多克隆抗体的制备
• 2.6 二化螟GOBP2基因在昆虫组织中的表达谱
• 2.6.1 gobp2基因半定量RT-PCR
• 2.6.2 GOBP2蛋白在不同组织中的SDS-PAGE及Western blot分析
• 2.7 二化螟触角普通气味结合蛋白的荧光特征检测
• 3 讨论
• 第3章 二化螟普通气味结合蛋白2基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的表达与鉴定
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 重组杆状病毒转移质粒pBacHT/CsupGOBP2的构建
• 1.3.2 重组Bacmid的获得
• 1.3.3 昆虫细胞的培养、转染及重组病毒的感染
• 1.3.4 SDS-PAGE分析
• 1.3.5 Western blot分析
• 2 结果与分析
• 2.1 重组杆状病毒转移载体的构建
• 2.2 重组病毒Bacmid的获得及重组Bacmid的转染、鉴定
• 2.3 SDS-PAGE及Western Blot分析
• 3.讨论
• 第4章 大螟和稻纵卷叶螟触角普通气味结合蛋白2基因部分序列的克隆及序列分析
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 昆虫触角总RNA的提取
• 1.2.2 提取的总RNA浓度及纯度的测定
• 1.2.3 PCR引物的设计及合成
• 1.2.4 cDNA第一链的合成
• 1.2.5 PCR扩增
• 1.2.6 PCR产物的纯化及克隆
• 1.2.7 大螟、稻纵卷叶螟GOBP2基因序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大螟、稻纵卷叶螟GOBP2基因的扩增和克隆
• 2.2 序列测定和分析
• 3.讨论
• 第5章 二化螟触角普通气味结合蛋白1基因的克隆、序列分析、表达及功能分析
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 菌株及质粒载体
• 1.1.4 气味分子
• 1.2 方法
• 1.2.1 PCR引物的设计及合成
• 1.2.2 二化螟gobp1基因片段的RACE扩增
• 1.2.3 PCR产物的纯化及克隆
• 1.2.4 二化螟gobp1基因全长的扩增
• 1.2.5 二化螟gobp1基因的序列分析
• 1.2.6 二化螟gobp1基因原核表达载体的构建
• 1.2.7 融合蛋白的表达及SDS-PAGE电泳分析
• 1.2.8 兔多克隆抗体的制备
• 1.2.9.诱导表达蛋白的纯化
• 1.2.10.荧光测定
• 2.结果与分析
• 2.1 cDNA序列分析
• 2.2 二化螟触角gobp1基因原核表达载体的构建
• 2.3 二化螟触角gobp1基因的诱导表达、抗体制备及蛋白纯化
• 3.讨论
• 第6章 二化螟信息素结合蛋白pbp2基因的克隆、序列分析、表达及功能分析
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1.-实验材料与试剂
• 1.2.昆虫触角总RNA的提取、检测、浓度测定
• 1.3.昆虫基因组DNA的提取
• 1.4 PCR引物的设计及合成
• 1.5 PBP部分片段的扩增
• 1.6 二化螟PBP基因片段的RACE扩增
• 1.7 PCR产物的纯化、克隆
• 1.8 二化螟pbp2基因的基因组DNA扩增
• 1.9 二化螟pbp2基因的序列分析
• 1.10.二化螟pbp2基因原核表达载体的构建
• 1.11.融合蛋白的表达及SDS-PAGE电泳分析
• 1.12.兔多克隆抗体的制备
• 1.13.诱导表达蛋白的纯化
• 1.14.荧光测定
• 1.14.1 荧光测定:
• 1.14.2 直接测定法
• 1.14.3 数据分析:
• 2.结果与分析
• 2.1 pbp2基因cDNA部分序列的扩增
• 2.2 pbp2基因的5'RACE、3'RACE扩增
• 2.3 pbp2基因cDNA序列的拼接及全长基因的扩增
• 2.4 二化螟pbp2基因的基因组DNA扩增及分析
• 2.5 二化螟pbp2基因原核表达载体的构建
• 2.6 二化螟PBP2融合蛋白的表达及SDS-PAGE分析及多克隆抗体的制备
• 2.7 诱导蛋白的纯化
• 2.8 荧光检测实验
• 3.讨论
• 第7章 二化螟和大螟嗅觉受体基因的克隆及序列分析
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 昆虫触角总RNA的提取
• 1.2.2 提取的总RNA浓度及纯度的测定
• 1.2.3 PCR引物的设计及合成
• 1.2.4 cDNA第一链的合成
• 1.2.5 PCR扩增
• 1.2.6 PCR产物的纯化及克隆
• 1.2.7 二化螟、大螟OR基因序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 二化螟、大螟OR基因的扩增和克隆
• 2.2 序列测定和分析
• 3.讨论
• 第8章 二化螟触角cDNA文库的构建、检测及相关基因筛选
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试虫源
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 二化螟触角RNA的提取及质量检测
• 1.2.2 第一链cDNA合成
• 1.2.3 cDNA的长距离PCR（LD-PCR）扩增
• 1.2.4 LD-PCR产物的蛋白酶K消化
• 1.2.5 cDNA的SfiI的酶切反应
• 1.2.6 cDNA片段的分级分离
• 1.2.7 cDNA与pDNR-LIB线性载体的连接
• 1.2.8 重组质粒的电转化
• 1.2.9 文库滴度测定、扩增及保存
• 1.2.10 文库重组率及插入片段长度的检测
• 1.2.11 相关基因的筛选
• 2.结果与分析
• 2.1 二化螟触角RNA的提取
• 2.2 cDNA文库构建质量的检测
• 3.讨论
• 第9章 结论和总讨论
• 参考文献
• 附录A 实验主要仪器和设备
• 作者简历