猪流产嗜性衣原体主要外膜蛋白的表达及ELISA诊断方法的建立

论文摘要

猪流产嗜性衣原体病是由流产嗜性衣原体感染引起猪不同征候群,临床上主要表现为妊娠母猪发生流产、公猪睾丸炎等。本试验对猪流产嗜性衣原体主要外膜蛋白进行克隆与序列分析,并通过对主要外膜蛋白的原核表达,建立了猪流产嗜性衣原体病的ELISA诊断方法。研究内容如下:（1）猪流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆与序列分析。从实验室保存的猪流产嗜性衣原体青海分离株感染的鸡胚卵黄囊中提取衣原体基因组。根据GenBank数据库中的衣原体MOMP基因序列设计两对引物,以提取的基因组DNA为模板,采用套式PCR技术扩增出对应的基因组序列。PCR产物经纯化后连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后,进行序列测定和生物信息学分析。序列分析结果显示,猪流产嗜性衣原体MOMP基因全长1170 bp,编码由389个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为41.8 ku。利用信号肽预测SignaIP 3.0 Server在线分析工具分析,1-19位氨基酸可能为信号肽序列。（2）猪流产嗜性衣原体MOMP基因的原核表达。设计一对表达引物,扩增除去MOMP基因的N端信号肽的氨基酸序列,经EcoR I和Sal I酶切后与经相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,产物进行SDS-PAGE和Western-blot检测,发现表达产物出现分子量66 ku的融合蛋白,与预期一致,并且能与猪流产嗜性衣原体病阳性血清发生反应。该分离株MOMP基因主要抗原区在pGEX表达载体中所表达的蛋白主要以包涵体的形式。对包涵体进行洗涤、溶解、电泳,切取含目的条带凝胶装入透析袋在电场中将蛋白洗脱出来。纯化包涵体可得到纯度较高的表达产物。该方法容易操作且蛋白损失较小,可以达到抗原抗体系列研究所需要的浓度要求。（3）间接ELISA诊断方法的建立。将纯化的重组蛋白作为包被抗原,包被96孔高亲和力ELISA板后,摸索反应条件,血清的稀释倍数为1:20,抗原的最佳稀释倍数为1:400;酶标二抗的最佳稀释倍数为1:80000;重组蛋白的最佳包被条件为37℃孵育1 h后4℃过夜;阴阳性临界点为0.381;建立了间接ELISA方法。在此基础上,又将间接ELISA方法和间接血凝试剂盒进行了比较试验,并测定150份田间血清样品,检测符合率达到了96.7%。该方法的建立为以后研制猪流产嗜性衣原体病诊断试剂盒提供了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 衣原体研究进展
• 1.1 衣原体概述
• 1.2 衣原体的分类
• 1.3 猪流产嗜性衣原体病及流行情况
• 1.4 衣原体分子生物学结构
• 1.4.1 包涵体膜蛋白基因
• 1.4.2 多形态膜蛋白基因
• 1.4.3 外膜蛋白基因
• 1.5 衣原体蛋白组学研究
• 1.5.1 包涵体膜蛋白
• 1.5.2 多态外膜蛋白
• 1.5.3 外膜蛋白
• 1.5.4 热休克蛋白
• 1.6 动物衣原体病的诊断技术
• 1.6.1 衣原体病分子生物学诊断
• 1.6.2 衣原体病的血清学诊断
• 实验研究
• 第二章 猪流产嗜性衣原体MOMP 基因的克隆与序列分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要工具酶及试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.1.5 引物
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 套式PCR 反应结果
• 2.3.2 重组质粒酶切和PCR 鉴定结果
• 2.3.3 序列分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 流产嗜性衣原体MOMP 基因序列分析
• 2.4.2 流产嗜性衣原体MOMP 推导氨基酸的分析
• 2.5 小结
• 第三章 猪流产嗜性衣原体MOMP 基因的原核表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 质粒、菌株及试剂
• 3.1.2 实验所用溶液及配制
• 3.1.3 引物的设计与合成
• 3.2 方法
• 3.2.1 重组表达载体的构建
• 3.2.2 重组质粒的鉴定
• 3.2.3 表达产物的检测
• 3.2.4 表达蛋白的纯化
• 3.2.5 表达蛋白Western-blot 分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组表达载体的构建
• 3.3.2 表达产物的检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 大肠杆菌表达重组蛋白抗原间接ELISA 方法的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要仪器、血清和试剂
• 4.1.2 主要试剂的配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 ELISA 最佳工作条件的确定
• 4.2.2 ELISA 方法的初步建立
• 4.2.3 阴阳性临界值的确定
• 4.2.4 特异性实验
• 4.2.5 敏感性实验
• 4.2.6 重复性实验
• 4.2.7 对比性实验
• 4.3 结果
• 4.3.1 最佳包被度和最佳血清稀释度的确定结果
• 4.3.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定结果
• 4.3.3 抗原最佳包被条件的确定结果
• 4.3.4 ELISA 阴阳性临界值的确定结果
• 4.3.5 特异性试验结果
• 4.3.6 敏感性试验结果
• 4.3.7 重复性试验结果
• 4.3.8 对比试验结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介