表面酰氯化修饰的磁性微粒对漆酶的固定化及其性质研究

论文摘要

与游离酶相比,固定化酶具有可以完全从反应物中分离出来,不会出现混合和稀释的问题,可以回收利用等优势。因此,开发出一种良好的固定化载体和固定化方法对酶工程方面的研究具有重要意义。本文主要应用海藻酸钠这种具有良好生物兼容性的材料制备磁性微粒应用于漆酶的固定化,并对固定化酶的各种酶学性质进行分析。使用乳化-交联法制备粒径为10-20μm的磁性海藻酸钠微粒,并用五氯化磷修饰磁性微粒表面生成酰氯基团,通过酰氯基团与漆酶游离氨基间形成酰胺键固定漆酶。通过正交实验将固定化条件进行优化,确定每30 mg载体的漆酶固定化条件为:固定化时间为30 min,酶浓度为100 U/mL,给酶量为5 mL,在此条件下获得的固定化漆酶与游离酶相比较,与底物ABTS亲和力降低,但稳定性有明显改善。对固定化漆酶与游离漆酶的最适pH、最适温度、热稳定性、米氏常数等酶学性质进行了比较,固定化漆酶反应的最适pH为3、温度为50℃,与游离漆酶相同;固定化漆酶的热稳定性明显优于游离酶,在70℃下持续7小时之后,固定化酶保持80%以上的活性,而游离酶的活性只残存10%;室温阴凉干燥处放置30 d,固定化酶酶活没有显著变化,存留66%的活性,而游离酶酶活下降较快,30天后酶活只有原来的19%;固定酶在反复使用10次后,仍能保持50%左右的活性。以上结果证明固定化后漆酶的稳定性得到显著提高。固定化酶还具有良好的可循环使用性和贮存稳定性。游离漆酶、固定化漆酶对染料刚果红降解实验的研究表明,12h降解率分别为22.59%、39.92%,固定化漆酶的脱色效果优于游离漆酶,说明固定化酶为漆酶的酶促反应提供了良好的微环境,在长时间的降解过程中,固定化酶受环境的影响较小,对pH和温度都有更大的适用范围,最终达到较高的降解效果。各项数据表明,表面改性的海藻酸钠磁性微粒是一种良好的固定化酶载体,具有广阔的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 漆酶简介
• 1.2.1 漆酶的结构及催化反应机理
• 1.2.2 漆酶的应用
• 1.3 固定化酶
• 1.3.1 固定化酶的定义
• 1.3.2 固定化酶的优点
• 1.3.3 酶的固定化方法
• 1.3.4 固定化酶的应用
• 1.4 磁性微粒
• 1.4.1 磁性微粒的结构及材质
• 1.4.2 磁性纳米粒子及磁性复合微粒的发展
• 1.4.3 磁性微粒作为酶固定化载体的优势
• 1.4.4 磁性微粒的制备方法
• 1.5 本课题的来源及研究的目的和意义
• 1.5.1 课题来源
• 1.5.2 研究的目的和意义
• 2 固定化酶的制备
• 2.1 材料
• 2.1.1 药品
• 2.1.2 仪器
• 2.2 方法
• 3O₄磁流体制备'>2.2.1 Fe₃O₄磁流体制备
• 2.2.2 磁性海藻酸钠微粒制备方法
• 2.2.3 磁性微粒酰氯化修饰
• 2.2.4 漆酶固定化
• 2.2.5 固定化酶的形态学观察
• 2.2.6 磁性微粒的IR表征
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 磁性微粒的光学显微镜照片
• 2.3.2 磁性微粒的激光共聚焦显微镜照片
• 2.3.3 磁性微粒电镜照片
• 2.3.4 傅立叶变换红外光谱图
• 2.4 本章小结
• 3 固定化酶的酶学性质
• 3.1 材料
• 3.1.1 药品
• 3.1.2 仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 酶活测定方法
• 3.2.2 最适固定化条件
• 3.2.3 酶学性质
• 3.2.4 刚果红降解实验
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 最适固定化条件
• 3.3.2 最适pH
• 3.3.3 最适温度
• 3.3.4 热稳定性
• 3.3.5 贮藏稳定性
• 3.3.6 反复使用稳定性
• 3.3.7 米氏常数
• 3.3.8 染料降解实验
• 3.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢