重组人p53转染淋巴瘤源性树突状细胞的抗肿瘤免疫效应

论文摘要

目的:树突状细胞（dendritic cell,DC）是目前已知唯一能激活初始T细胞（naive Tcells）功能最强的抗原递呈细胞（antigen presenting cells,APC）,因其强大的抗原递呈功能和激活抗原后特异性的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes CTL）反应,成为肿瘤生物免疫治疗的重要载体,而淋巴瘤源性DC（L-DC）既带有淋巴瘤瘤细胞抗原,同时又是抗原提呈细胞,来源于患者本人,不存在MHC限制性,能有效地激活特异的抗肿瘤免疫,在淋巴瘤的生物免疫治疗中发挥重要作用。但L-DC与正常人CD14+或CD34+前体细胞来源的CD83+的DC相比,其迁移、吞噬作用及抗原加工递呈功能减弱,使抗肿瘤免疫应答能力下降,同时由于肿瘤细胞释放细胞免疫抑制因子,引起DC的免疫耐受,这样就限制了DC在淋巴瘤免疫治疗中的作用,如何获得更具抗原递呈功能的DC,打破免疫耐受,成为目前研究的热点。有研究表明,p53基因突变和过度表达与NHL的发生发展有关[1],在弥漫性大B细胞淋巴瘤中,其异常表达率可高达50%[2]。目前,体内和体外试验,应用重组人p53腺病毒（rAd-p53）,把wt-p53基因导入实体瘤中或与实体瘤细胞株共培养,可产生瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡,同时增强了放疗的敏感性,从而使rAd-p53成为治疗实体瘤另外一种途径,为肿瘤的治疗提供了一种新的“武器”[3-10]。并且发现腺病毒p53修饰DC后可使其表达内源性抗原,上调DC共刺激分子表达,产生特异性CTL效应。因此,如何获得临床上需要的有功能的L-DC及纠正瘤细胞内的突变的p53基因的功能,是急需解决的问题。目前,虽然分子靶向治疗药物的问世,如CD20单抗（美罗华）等,使得DLBCL的治愈率提高了很多,但在淋巴瘤的治疗中如何解决微小残留病灶（MRD）、DC免疫耐受等问题,仍然是目前临床治疗淋巴瘤遇到的难题,因此,我们利用rAd-p53能否诱导淋巴瘤瘤细胞为成熟DC,作为肿瘤疫苗治疗淋巴瘤及解决MRD、DC免疫耐受问题是本实验目的所在。方法:采集经病理确诊的弥漫性大B细胞淋巴瘤的淋巴结和外周血的单个核细胞（MNC）进行培养。分为3组:实验组A（淋巴结源性DC转染rAd-p53,L-rAd-p53-DC）,实验组B（外周血源性DC转染rAd-p53,P-rAd-p53-DC）;对照组A（淋巴结源性DC转染rAd,L-rAd-DC）,对照组B（外周血源性DC转染rAd,P-rAd-DC）;空白对照组A（淋巴结源性DC未转染,L-N-DC）,空白对照组B（外周血源性DC未转染,P-N-DC）,以上各组均用GM-CSF+IL-4培养,至第7天,实验组加rAd-p53;对照组加rAd;空白对照组未加任何物质;各组于培养第8天加入TNF-a+CD40mAb继续培养48小时后,流式细胞仪检测DC免疫表型、酶联免疫吸附法（ELISA）进行上清夜IL-12水平测定,四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法观察各组刺激T淋巴细胞增殖能力（MLR）及乳酸脱氢酶（LDH）法针对淋巴瘤瘤细胞的细胞毒作用（CTL效应）。在分离外周血过程中,贴壁的进行DC培养,非贴壁的培养成效应细胞。结果:淋巴结源性和外周血源性的单个核细胞,经培养后均成功获得具有树突状突起的细胞,但以实验组树突状突起明显。结果显示:DC的表型(CD1a除外)CD83、CD80、CD86和HLA-DR实验组均较对照组及空白对照组明显增高（p＜0.05）。上清液中IL-12分泌水平实验组均较对照组及空白对照组明显增高（p＜0.05）。实验组具有明显的刺激自体淋巴细胞增殖的能力,且刺激能力随rAd-p53-DC与淋巴细胞比例的增加而升高。对照组也能刺激同种自体淋巴细胞增殖的能力,但较实验组组差（p＜0.05）。对靶细胞的细胞毒作用（CTL效应）结果显示,实验组介导的细胞杀伤率显著高于对照组及空白对照组（P＜0.05）。且实验组A的CTL效应明显高于实验组B,两者之间有显著性差异（P＜0.05）。结论:利用rAd-p53可以成功地诱导弥漫性大B细胞淋巴瘤瘤细胞和外周血来源单个核细胞为树突状细胞,形态学观察及细胞表型检测证实均为成熟DC,其IL-12分泌水平及介导的MLR和CTL效应明显强于非rAd-p53组所诱导的DC组。提示以rAd-p53-DC为基础的肿瘤疫苗有可能在解决淋巴瘤的MRD、DC免疫耐受等问题上发挥强大的治疗作用,为淋巴瘤的治疗研究提供了一个新的思路和策略。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 硕士期间研究成果
• 致谢
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• 综述