坪草腐霉病菌除草活性毒素组分的分离鉴定与突变菌株的DDRT差异显示分析

论文题目: 坪草腐霉病菌除草活性毒素组分的分离鉴定与突变菌株的DDRT差异显示分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 张金林

导师: 董金皋

关键词: 瓜果腐霉病菌,毒素,除草活性,结构鉴定,基因差异表达

文献来源: 河北农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 坪草腐霉病是一种发病迅速、对草坪破坏力极强的病害。坪草腐霉病菌在高温、高湿条件下对多年生黑麦草等禾本科坪草具有很强的致病性,可以引起坪草的大面积死亡。本试验从多年生黑麦草上分离得到了5株腐霉菌（编号依次为PA1、PA2、PA3、PA4、PA5）,通过鉴定,PA1和PA5菌株为瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）。在此基础上对PA1菌株的生物特性、毒素产生的适宜条件、毒素的分离纯化与结构鉴定和毒素产生的差异性表达进行了研究。通过测定发现,PA1和PA5菌株菌丝生长的最适温度为32～34℃,菌种保存的适宜温度为10～15℃;20℃条件下,在CMA培养基和燕麦粉液体培养基中可以大量产生臧卵器和卵孢子;5～15℃条件下,可以产生孢子囊。将所得5株菌株分别在PD培养基、PS培养基、玉米粉培养基、改良Fries培养基、Czapek-Dox培养基和Richard培养基中进行培养,所得培养滤液、粗毒素对马唐和反枝苋的除草生物活性进行了测定。结果表明,在PD培养基中所产生的毒素除草生物活性最强,在供试的5株菌株中以PA1菌株所产生的毒素除草活性最强。PA1菌株在PD培养基中培养所得粗毒素对马唐、反枝苋、虎尾草、金色狗尾草、野燕麦、稗草、藜、播娘蒿和荠菜9种杂草的生长有明显的抑制作用;对玉米、小麦有轻微药害,而对大豆安全。试验发现,PA1菌株产毒的适宜pH值为7.0,以培养5d的毒素除草活性最强;在100～150r/min条件下,振荡培养所得粗毒素的除草活性要明显高于静止培养。通过测定,在培养过程中PA1菌株对葡萄糖的利用率要明显高于蔗糖。利用紫外线对PA1菌株的菌丝进行了不同时间的照射处理,得到了18株诱变菌株（PAM1～18）。通过生长速率测定法测定了诱变菌株的生长量,结果发现,PAM1菌株的生长速率最快,其次是PAM2、PAM16、PAM12、PAM4,这5株菌株菌丝的生长量明显高于野生菌株。诱变菌株所得粗毒素对马唐和反枝苋的生长抑制作用结果表明,以PAM1的除草活性最高。对PAM1诱变菌株进行了发酵试验,在72h的发酵过程中发酵液的pH值逐渐降低。用发酵液制备所得粗毒素的除草活性与在150r/min条件下振荡5d所得粗毒素的活性相当,均明显高于静止培养所得粗毒素。分别用乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷等体积萃取PA1菌株培养滤液并制备粗毒素,除草活性测定结果表明,用乙酸乙酯萃取所得粗毒素的活性最高。通过硫酸铵和乙醇沉降法得到培养滤液中的蛋白质,用蛋白质稀释液处理黑麦草后可引起典型的症状,但对杂草生长没有抑制作用。试验发现,培养滤液中的除草活性物质在高温下不稳定,降低培养滤液的pH值、提高盐浓度均可以提高乙酸乙酯的萃取效率,利用活性炭可以有效的吸附培养滤液中除草活性物质。利用薄层层析法,将具有除草活性物质在乙酸乙酯:石油醚:乙酸=1:15:0.25的展开剂中可以得到有效分离。通过对所得不同Rf值物质的除草生物活性测定表明,以Rf值为0.74、0.41、0.19的物质除草活性最强,对马唐的生长抑制作用均达95%以上;其次为Rf值为0.68、0.64、0.58、0.35,对马唐的生长抑制作用均为85%。利用高压液相色谱仪分别对Rf值为0.19、0.35、0.74的物质进行制备,得到了具有除草活性的组分,分别为组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ、组分Ⅳ。对组分Ⅰ的红外光谱、13C-NMR、1HNMR分析表明,组分Ⅰ为邻苯二甲酸二甲酯。生物测定发现2mg/mL、4mg/mL的邻苯二甲酸二甲酯对马唐的生长抑制作用分别为65%和95%以上。利用冷冻离心法从粗毒素和菌丝提取物中分离纯化得到了组分Ⅴ,通过IR、

论文目录:

引言

第一章坪草腐霉病菌毒素产生除草活性物质的条件优化

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

1.1.2 供试培养基

1.1.3 供试植物

1.1.4 供试试剂

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离

1.2.2 菌饼的制备

1.2.3 菌种的鉴定

1.2.4 病菌粗毒素的制备

1.2.5 毒素产生条件的优化

1.2.6 病原菌培养过程中糖的利用率测定

1.2.7 菌株的紫外诱变

1.2.8 高除草活性诱变菌株的发酵试验

1.2.9 除草活性测定

2 结果与分析

2.1 菌种的分离纯化

2.2 PA1和PA5菌株的鉴定及生物学特性

2.2.1 PA1和PA5菌株的鉴定结果

2.2.2 PA1、PA5菌株在不同温度下的生长速率测定结果

2.2.3 菌种的保存条件

2.3 不同培养基对坪草腐霉菌产生除草活性物质的影响

2.4 坪草腐霉粗毒素对作物的安全性和杀草谱

2.5 影响坪草腐霉产生除草活性物质的条件

2.5.1 培养时间的影响

2.5.2 不同pH值的影响

2.5.3 振荡和静止培养的影响

2.6 孢子囊和卵孢子产生毒素对杂草的抑制作用

2.7 不同培养时间PD培养基中葡萄糖和PS培养基中蔗糖含量的变化

2.8 紫外线诱变菌株的生长量和对杂草的抑制作用

2.8.1 不同诱变菌株生长量

2.8.2 不同诱变菌株的毒素对杂草的抑制作用

2.9 诱变菌株发酵滤液pH值的变化及粗毒素除草生物活性测定

3 讨论

第二章坪草腐霉病菌具有除草活性组分分离纯化与结构鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

1.1.2 供试培养基

1.1.3 供试植物

1.1.4 供试试剂

1.1.5 供试仪器

1.2 方法

1.2.1 粗毒素的制备

1.2.2 培养滤液中蛋白质的分离

1.2.3 影响除草活性物质分离的条件

1.2.4 菌丝中除草活性物质的提取

1.2.5 粗毒素中除草活性物质的初分离——萃取法

1.2.6 除草活性初分离物的性质鉴定

1.2.7 活性物质的分离——薄层层析法

1.2.8 除草活性组分的制备——高效液相色谱法

1.2.9 粗毒素和菌丝中白色油状物的分离和溶解度测定

1.2.10 除草活性组分的结构鉴定

2 结果与分析

2.1 不同有机溶剂萃取所得粗毒素对杂草种子萌发及生长抑制作用

2.2 分离蛋白质及蛋白质分离后的培养滤液粗毒素的除草活性测定

2.3 培养滤液不同pH值对除草活性的影响

2.4 培养滤液温度对除草活性的影响

2.5 培养滤液的盐浓度对除草活性物质萃取的影响

2.6 活性炭对培养滤液中的除草活性组分的吸附作用

2.7 菌丝提取物对杂草的生物活性

2.8 粗毒素中除草活性物质的初步分离

2.9 除草活性物质的官能团鉴定

2.10 除草活性物质的分离——薄层层析法

2.10.1 不同展开剂对除草活性物质的分离效果

2.10.2 不同Rf值物质的除草活性

2.11 除草活性组分的分离和制备——高效液相色谱法

2.11.1 Rf值为0.19的分离物除草活性组分的制备

2.11.2 Rf值为0.35的分离物除草活性组分的制备

2.11.3 Rf值为0.74的分离物除草活性组分的制备

2.12 除草活性组分的结构鉴定

2.12.1 组分Ⅰ的结构鉴定

2.12.2 邻苯二甲酸二甲酯的除草活性

2.13 粗毒素和菌丝提取物中白色油状物的分离及生物活性

2.13.1 粗毒素和菌丝提取物中白色油状物的分离

2.13.2 组分Ⅴ的结构鉴定

2.13.3 组分Ⅴ的生物活性测定

3 讨论

第三章坪草腐霉病菌毒素产生基因表达的差异

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

1.1.2 供试培养基

1.1.3 试剂和引物

1.1.4 主要仪器和设备

1.2 方法

1.2.1 供试菌种培养不同时间菌丝的取样

1.2.2 供试菌株总RNA的提取

1.2.3 除去RNA中的DNA

1.2.4 cDNA第一链的合成

1.2.5 DDRT-PCR扩增

1.2.6 6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.2.7 差异表达片段回收和二次PCR扩增

1.2.8 二次扩增产物的检测

1.2.9 感受态大肠杆菌细胞的制备

1.2.10 PCR产物与质粒载体的连接

1.2.11 转化大肠杆菌

1.2.12 质粒DNA提取

1.2.13 插入片段酶切检测

1.2.14 基因片段测序与序列分析

2 结果与分析

2.1 RNA提取结果

2.2 引物的选择

2.3 PCR扩增产物的分离

2.4 PA1菌株和PAM1菌株培养不同时间基因表达的差异

2.5 二次扩增结果

2.6 阳性克隆的筛选结果

2.7 插入片段的酶切检测结果

2.8 测序结果与分析

3 讨论

结论

参考文献

附：图版1-12

在读期间发表的学术论文

个人简历

致谢

发布时间: 2005-08-10

参考文献

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[2].糖缀合物的合成及其除草活性研究[D]. 王小明.吉林大学2006
[3].新型4，6-二甲氧基嘧啶类衍生物的合成及除草活性研究[D]. 李元祥.华中师范大学2007
[4].新型除草剂的制备及应用研究[D]. 丁光龙.中国农业大学2017
[5].新型三酮类HPPD抑制剂的设计、合成及生物活性研究[D]. 王大伟.华中师范大学2015
[6].新型苯并噻咪类PPO抑制剂的设计、合成及除草活性研究[D]. 左炀.华中师范大学2013
[7].基于结构的新型原卟啉原氧化酶抑制剂的合理设计、合成和除草活性[D]. 张莉.华中师范大学2007
[8].瓜果腐霉代谢产物中除草活性物质的分离与鉴定[D]. 张利辉.河北农业大学2009
[9].新型三唑啉酮和四唑啉酮衍生物的合成及生物活性研究[D]. 骆焱平.华中师范大学2007
[10].辣根素类化合物的合成及生物活性的研究[D]. 吴华.华中农业大学2010

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