人呼吸道合胞病毒适应性传代的研究

论文摘要

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是造成婴幼儿肺炎和细支气管炎的主要病原体,同时也是造成免疫力低下的病人及老人发病和死亡的重要原因。因此,有必要开发出一种疫苗来预防RSV,但至今还没有安全有效的疫苗问世。RSV冷适应减毒疫苗具有独特的优势而成为最有潜力的候选疫苗。本研究将筛选到的RSV毒株在Vero细胞上进行冷适应,在A549细胞上评价适应株的冷适应性和温度敏感性,并通过动物实验评价适应株的减毒特性和免疫原性。本实验的研究工作包括两个部分：(1)RSV病毒冷适应；(2)RSV适应株生物学特性评价,包括冷适应性、温度敏感性、减毒特性和免疫原性的评价。(1)RSV毒株的冷适应本实验从155份儿童的痰样中筛选到14份RSV病毒株,这些毒株和RSV Long株在Vero细胞上37℃传代5次、32℃传代10次、28℃传代15次、25℃传代10次,淘汰在传代过程中不能引起细胞病变的毒株,在25℃冷适应结束时,只有KM300、KM501、KM516、 KM518、RSV Long株还能引起细胞病变,通过测序和比对,确定都是RSV病毒。(2)RSV适应株生物学特性评价RSV毒株在25℃冷适应结束时,用A549细胞测定适应株在25℃、32℃和39℃时的感染滴度,评价适应株的冷适应性和温度敏感性,可以看出KM300、KM501、KM516、KM518、 RSV Long株只有温度敏感性没有冷适应性。将RSV适应株和野毒株接种小鼠,4天后取肺脏做病理切片,可以看出RSV适应株KM300、KM501、KM516有一定的减毒效果。随后测定上下呼吸道残余病毒滴度,结果表明在体内RSV适应株病毒复制能力比野毒株低。接种两周后取外周血的血清,测定血清中总抗体和中和抗体,以及肺部灌洗液的总抗体和中和抗体,评价RSV适应株的免疫原性。小鼠接种后的血清总抗体效价在1：50～1：300,血清中和抗体效价为1：2.82～1：5.62,肺部灌洗液总抗体滴度为1：4～1：8,肺部灌洗液中和抗体为1：2～1：3.98,适应株的抗体滴度与野毒株相当,说明适应株有良好的免疫原性。本论文将RSV毒株进行了冷适应,对RSV适应株的冷适应性、温度敏感性、减毒特性、免疫原性进行了评价,为更好更深入地研究RSV冷适应疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语索引
• 第一章 前言
• 1.1 呼吸道合胞病毒基本特征
• 1.2 呼吸道合胞病毒疫苗研究进展以及存在的问题
• 1.2.1 呼吸道合胞病毒疫苗研制面临的困难
• 1.2.2 呼吸道合胞病毒疫苗研制历程
• 1.2.3 减毒活疫苗优势和研制情况
• 1.3 本论文研究的理论依据、目的和意义
• 1.3.1 本论文研究的理论依据
• 1.3.2 本论文研究的背景、目的和意义
• 第二章 RSV毒株冷适应与鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂及药品
• 2.1.3 溶液配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 毒株的初步筛选和增殖
• 2.2.2 毒株的初步鉴定与测序
• 2.2.3 冷适应过程中RSV毒株生长情况
• 2.2.4 RSV适应株挑单斑纯化
• 2.2.5 RSV适应株鉴定
• 2.3 讨论
• 2.3.1 毒株的增殖、鉴定
• 2.3.2 RSV冷适应传代
• 2.3.3 RSV毒株冷适应过程中的鉴定
• 2.4 本章小结
• 第三章 RSV适应株生物学特性测定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验动物、细胞和毒株
• 3.1.2 主要试剂和仪器
• 3.1.3 主要溶液配制
• 3.1.4 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 RSV在A549细胞和Vero细胞上的病毒滴度
• 3.2.2 RSV毒株的感染滴度以及适应株的冷适应性和温度敏感性
• 3.2.3 接种后小鼠体重变化和脏器系数
• 3.2.4 小鼠病理切片观察
• 3.2.5 小鼠上下呼吸道残余病毒滴度
• 3.2.6 小鼠IL-4和IFN-γ测定
• 3.2.7 病毒蛋白和细胞蛋白含量测定
• 3.2.8 RSV适应株免疫原性测定
• 3.2.9 RSV毒株的生物学特性总结
• 3.3 讨论
• 3.3.1 A549细胞和Vero细胞的选用
• 3.3.2 RSV适应株的生物学特性
• 3.3.3 动物模型和接种方式的选择
• 3.3.4 RSV适应株的减毒特性
• 3.3.5 RSV适应株在体内复制
• 3.3.6 小鼠IL-4和IFN-γ测定
• 3.3.7 小鼠免疫原性测定
• 3.4 本章小结
• 第四章 全文总结
• 第五章 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文及参与项目目录