论文摘要
急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是危重患者的一常见临床问题,并且是不良预后的独立危险因素,重症患者AKI的发生率为36%,虽然AKI的病因是多因素的,但脓毒症一直是其首要原因,AKI的病因50%以上是脓毒症,而且脓毒症AKI患者的病死率要明显高于非脓毒症AKI患者。回顾近50年来,虽然在重要脏器支持及复苏手段方面取得了一些进步,但脓毒症相关AKI的发病率和病死率仍居高不下,主要原因是其病理生理机制尚不十分清楚。传统的观点认为肾的缺血/低灌注即肾血流动力学的改变是脓毒症AKI的主要发病机制,其所导致的肾小管上皮细胞坏死是脓毒症AKI的主要病理生理机制,并通过补液治疗和应用血管活性药物来增加平均动脉压,恢复。肾血流,改善肾功能,但是,此观点受到争议,因为此观点多来自肾缺血和药物损伤动物模型的研究结果,与临床脓毒症不相符,而且目前没有随机对照实验来支持这个观点,而更多的研究证实：脓毒症AKI时肾血流实际上是增加的,肾皮、髓质的血流分布是没有变化的。所以,肾的低灌注在低动力血流动力学状态下可能是重要的,但是,在液体复苏后、高动力持续进展的脓毒症AKI中,可能不是关键性的；而且现有的,包括动物实验和临床研究均不能证明肾小管坏死是脓毒症AKI的主要病理表现。随着研究的深入,学者们发现肾组织细胞凋亡可能是AKI主要病理生理机制,而不仅仅是坏死,如肾毒性物质甘油一AKI、缺血再灌注一AKI以及内毒素一AKI,但是目前国内外有关“肾细胞凋亡”在多种微生物感染脓毒症性AKI（人类最常见的脓毒症性AKI）中作用的研究还很少,还需要进一步研究探讨。病原微生物进入机体,导致肾细胞凋亡,引起AKI,此过程很复杂,最重要的问题是：哪些受体识别这些细菌,然后怎样启动并保持炎症反应、怎样引起凋亡呢?Toll样受体（toll like receptors, TLRs）的发现使我们对此理解发生了革命性的变化。TLRs存在于固有免疫系统和适应性免疫系统细胞上,提供了病原体和生物相互作用的界面,了解其信号转导途径和它们复杂的调节机制对于理解脓毒症复杂的表象很有意义。TLRs不仅存在于免疫系统,也存在于组织和器官,如心脏、肾脏、肝脏等,而且TLRs可以与内源性非微生物物质相互作用的事实使我们对这些分子的理解又增加了复杂性。目前国内外文献有关TLRs在脓毒症性AKI中作用的报道很少,存在争议。小RNA干扰（small interference RNA, siRNA）是近年研究证明的一种基因沉默技术,具有高度序列专一性,能有效沉默特定基因的表达,且方法简单可行。基于以上问题,本系列研究通过建立与临床脓毒症密切相关的脓毒症模型一盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture, CLP）,制备多菌感染脓毒症AKI小鼠模型,应用动物和细胞实验、病理形态学、生物化学、酶联免疫吸附法、流式细胞术、分子生物学等方法探讨脓毒症AKI小鼠模型制备,并分别应用选择性caspase-3抑制剂、TLR4/9 siRNA预防性干预,观察对肾组织细胞凋亡、炎症反应、肾功能及预后的影响,研究和探讨肾组织细胞凋亡、炎症反应、TLR4/9在脓毒症AKI中的作用并进行脓毒症AKI机制探讨,以期为临床预防和治疗脓毒症AKI提供实验基础和理论依据。本课题五部分的具体内容如下：第一部分脓毒症AKI小鼠模型制备目的：探讨一种简单易行、重复性好,且接近临床的AKI动物模型的制备方法。方法：健康清洁级雄性C57BL/6小鼠68只,随机分为假手术（sham组）和模型组（CLP组,盲肠结扎穿孔术组）。根据实验要求,二组均在制模后设置6h、12h、24h三个时间点组,每组每个时间点组8只小鼠,检测血内毒素水平、进行血培养,检测血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）浓度,光镜、电镜下观察肾组织病理学改变,每组余10只小鼠观察生物学行为变化（包括精神、皮毛色泽、饮食、活动等）及4天、7天存活率。计量资料以均数士标准差（x±s）表示,二组间比较采用t检验,多组间比较采用LSD单因素方差分析,应用Kaplan-Meier法计算累计生存率并绘制生存曲线,生存曲线的比较采用log-rank检验。结果：1血内毒素水平：CLP组较sham组显著升高（P<0.05）；血培养：sham组为阴性,CLP组可检出大肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌属和少量格兰阳性球菌。2Sham组小鼠各项生物学行为很快恢复正常,CLP组小鼠制模后6-12h表现为明显的早期脓毒症特征,持续至48-72h。3 CLP组,6hCr较sham组显著升高（P<0.05）,12h后开始下降,与sham组没有显著性差异（P>0.05）,但仍高于sham组；BUN各时间点均显著高于sham组（均P<0.05）。4 CLP组肾组织病理损伤评分各时间点均显著性高于sham组（均P<0.05）。5Sham组制模后4天、7天小鼠全部存活,CLP组4天、7天病死率分别为50%、80%,二组比较有显著性差异（P<0.05）。小结：CLP小鼠血内毒素浓度明显增高、血培养阳性,且为多种细菌的混合感染,伴有远隔脏器一肾脏功能受损及肾脏组织病理损伤,不伴有坏死现象,证明脓毒症AKI模型制备成功。CLP诱导的多菌感染脓毒症AKI模型是简单且可复制的。第二部分肾组织细胞凋亡在脓毒症AKI小鼠中的作用及选择性caspase-3抑制剂预防性干预的研究目的：探讨肾组织细胞凋亡在腹腔多种微生物感染脓毒症诱发急性肾损伤（AKI）中的作用,以及选择性caspase-3抑制剂预防性应用的作用。方法：健康清洁级雄性C57BL/6小鼠102只,随机分为假手术组（sham组）、模型组（CLP组,盲肠结扎穿孔术组）和半胱氨酸蛋白酶（caspase）.3抑制剂组（CI组,CLP术前30min给予caspase-3特异性拮抗剂Ac-DEVD-CHO,4μg/g腹部皮下注射）。根据实验要求,三组均在制模后设置6h、12h、24h三个时间点组,每组每个时间点组8只小鼠,检测血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）浓度,用流式细胞术和TUNEL法检测肾组织细胞凋亡,实时荧光定量PCR法检测肾组织caspase-3mRNA表达,免疫组化法检测caspase-3在肾脏的表达,观察小鼠肾组织病理学,每组余10只小鼠观察生物学行为变化及4天、7天存活率。计量资料以均数士标准差（x±s）表示,多组间比较采用LSD单因素方差分析,多个独立样本非参数检验采用Kruskal-Wallis H检验,采用Kaplan-Meier法计算累计生存率并绘制生存曲线,生存曲线的比较采用log-rank检验。结果：1Sham组、CLP组小鼠生物学行为改变基本同第一部分,CI组小鼠术后表现程度轻于CLP组。2血清Cr：与sham组比较,CLP组6h Cr浓度显著升高（P<0.05）,12h后开始下降,与sham组没有显著性差异（P>0.05）,但仍高于sham组；与CLP组比较,CI组血清Cr浓度6h显著性降低（P<0.05）,但仍显著性高于sham组（P<0.05）,于12h、24h持续降低至sham组水平（P>0.05）。血清BUN：与sham组比较,CLP组各时间点BUN浓度均显著升高（P<0.05）；与CLP组比较,CI组各时间点的血清BUN浓度均显著性降低（P<0.05）,与sham组相比没有显著性差异。三组血清Cr、BUN浓度组内比较各时间点均没有显著性差异（P>0.05）。3光镜下sham组、CLP组肾组织病理损伤变化基本同第一部分；CI组肾小球、肾小管损伤轻于CLP。三组均未见肾细胞坏死现象。与sham组相比,CLP组各时间点肾组织病理损伤评分均显著性增加（P<0.05）,CI组6h、12h肾组织病理损伤评分显著高于sham组（P<0.05）；与CLP组相比较,CI组各时间点均有降低,但无显著性差异（P>0.05）,并于24h达到sham组水平（P>0.05）；三组组内比较各时间点均无显著性差异（P>0.05）。4与sham组比较,CLP组各时间点肾组织细胞凋亡率显著性升高（均P<0.05）,分别为（18.27±1.4vs.6.17±0.9、15.86±3.5vs.5.60±0.6、12.48±2.1 vs.5.64±0.5）（%）；与CLP组比较,CI组各时间点的肾组织细胞凋亡率显著性降低（均P<0.05）,分别为（13.88±3.2、10.48±3.6、8.45±1.8）（%）,但仍显著性高于sham组（P<0.05）; sham组组内比较没有显著性差异（P>0.05）,CLP组、CI组肾组织细胞凋亡率逐渐降低,并于24h显著性低于6h（P<0.05）。5与sham组相比,CLP组各时间点肾组织caspase-3mRNA表达均显著性上调（P<0.05）；与CLP组比较,CI组各时间点肾组织caspase-3mRNA表达均显著性降低（P<0.05）, Ac-DEVD-CHO对caspase-3mRNA表达的抑制率在53%左右。Sham组、CI组组内比较没有显著性差异（P>0.05）,CLP组肾组织caspase-3mRNA表达呈上升趋势,并于24h较6h比较有显著性差异（P<0.05）。Caspase-3蛋白主要表达于肾小管上皮细胞、肾小球血管内皮细胞胞质和胞核中。Caspase-3蛋白在CLP组表达增多,CI组有所降低,但是三组比较均没有显著性差异（P>0.05）。6 Sham组、CLP组、CI组4天存活率分别为100%、40%、80%,CLP组、CI组与sham组比较差异有统计学意义（P<0.05）；CI组与模型组比较差异虽无统计学意义,但CI组死亡小鼠的存活时间可延长24h左右。Sham组、CLP组、CI组7天存活率分别为100%、20%、20%,假手术组与后两组比较差异有统计学意义（均P<0.05）。小结：1肾组织细胞凋亡是脓毒症AKI小鼠主要肾组织病理特点,未见细胞坏死现象。2脓毒症AKI小鼠肾组织caspase-3表达显著性增高,Ac-DEVD-CHO显著降低脓毒症AKI小鼠肾组织caspase-3表达,从而降低了肾组织细胞的凋亡率,并且减轻了肾组织病理损伤,改善了肾功能,说明肾组织细胞凋亡可能是多菌感染脓毒症AKI的主要病理生理机制；选择性caspase-3抑制剂预防性应用对腹腔多菌感染脓毒症AKI小鼠肾功能有保护作用,此为进一步研究脓毒症AKI发病机制及进行抗凋亡的临床研究提供了理论依据。3应用Ac-DEVD-CHO没有改善最终预后,提示在平衡脓毒症和凋亡中,有众多因素参与,还需要进一步研究探讨。第三部分炎症反应在脓毒症AKI小鼠中的作用及选择性caspase-3抑制剂预防性干预的研究目的：探讨炎症反应在腹腔多种微生物感染脓毒症诱发急性肾损伤（AKI）中的作用,以及炎症反应和肾组织细胞凋亡之间的关系及选择性caspase-3抑制剂对其的影响。方法：实验动物、分组及模型制备方法同第二部分。应用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、白细胞介素（interleukin, IL）-6、IL-10水平,其余观察检测同第二部分。统计方法同第二部分。结果：1小鼠生物学行为改变同第二部分。2小鼠肾功能改变同第二部分。3小鼠肾组织病理损伤变化同第二部分。4小鼠肾组织细胞凋亡及caspase-3表达变化同第二部分。5与sham组比较,CLP组CLP后各时间点血清TNF-α、IL-6、IL-10水平显著性升高。TNF-α（μg/L）:6h:653.6±8.9 vs. 29.5±19.0,12h:579.7±137.1 vs.28.3±9.3,24h:551.0±119.8 vs.26.3±8.9, （P<0.05）; IL-6（μg/L）:6h:1595.3±159.4 vs.38.2±8.5,12h:1330.7±249.8 vs.32.0±9.0,24h:815.3±572.7 vs.24.3±9.7, （P<0.05）;IL-10（μg/L）:6h: 26.6±4.5 vs.5.1±1.2,12h:24.5±4.3 vs.4.9±1.0,24h:18.2±1.6 vs.4.9±1.2, （P <0.05）。与CLP组比较,CI组各时间点血清TNF-α、IL-6水平显著性降低[TNF-α（μg/L）:436.2±64.2,233.4±85.4,151.0±90.3;IL-6（μg/L）: 1033.2±345.8,366.3±68.3,241.2±208.4,均P<0.05)],但仍显著性高于sham组（P<0.05）,IL-10水平12h、24h显著性升高（37.2±5.0, 38.3±5.5,均P<0.05）。6三组小鼠病死率同第二部分。小结：1脓毒症AKI时血清促炎介质TNF-α、IL-6浓度及抗炎介质IL-10浓度均显著性增高,其中促炎介质TNF-α、IL-6升高倍数更是明显高于抗炎介质IL-10,6h分别升高22.13倍、41.78倍、5.218倍,伴有肾功能下降、肾组织细胞凋亡增加、存活率降低。2 Caspase-3抑制剂通过降低脓毒症AKI肾组织细胞凋亡率,下调肾脏caspase-3mRNA水平,显著下调了血清促炎介质TNF-α、IL-6水平,上调了抗炎介质IL-10水平,平衡了炎症反应综合征和代偿性抗炎反应综合征,改善了肾功能,降低了病死率。3上述结果表明炎症反应是多菌感染脓毒症AKI的主要发病机制之一,通过干预凋亡能够调整、平衡炎症反应,由此进一步证明肾细胞凋亡在多菌感染脓毒症AKI中的重要作用。此为进一步研究脓毒症AKI发病机制及进行抗凋亡的临床研究提供了理论依据。第四部分TLR4/9在脓毒症AKI小鼠中的作用及其siRNA预防性干预的研究目的：观察腹腔多菌感染脓毒症AKI时肾组织TLR4/9的表达及Toll样受体4/9小干扰RNA对腹腔多菌感染脓毒症急性肾损伤小鼠肾细胞凋亡的影响,探讨TLR4/9在多菌感染脓毒症AKI发病机制中的作用。方法：1体外实验：选用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞进行体外培养。针对小鼠TLR4和TLR9编码序列分别设计2条体外转录的小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）:S-T41、S-T42、S-T91和S-T92。优化转染条件后将siRNA分别转染入RAW264.7细胞,于转染后48小时收集细胞,应用实时荧光定量方法和免疫印迹法检测TLR4,9mRNA、蛋白表达,确定沉默效果最佳,且相互之间没有非特异性沉默的siRNA,将其用作体内实验。2体内实验：健康清洁级雄性C57BL/6小鼠170只,随机分为5组,假手术组（sham组）、空白对照组（S-B组）、空质粒对照组（S-N组）、TLR4 siRNA干预组（S-T4组）、TLR9 siRNA干预组（S-T9组）。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）制备脓毒症AKI小鼠模型,各组均于制模前24h应用尾静脉水动力注射法注射TransIT-EE Hydrodynamic Delivery Solution（水动力注射液,美国Mirus Bio公司）1.5ml,空质粒对照组、siRNA干预组分别随之导入空质粒、TLR4/9 siRNA质粒50μg,5s注射完。CLP方法同第一部分。根据实验要求,五组均在制模后设置6h、12h、24h三个时间点组,每组每个时间点组8只小鼠,检测血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）浓度,用流式细胞术和TUNEL法检测肾组织细胞凋亡,实时荧光定量PCR法检测肾组织caspase-3mRNA、TLR4表达,免疫组化法检测caspase-3、TLR4在肾脏的表达,每组余10只小鼠观察生物学行为变化及4天、7天病死率。统计方法同第二部分。结果：1体内实验：S-T41、S-T91分别较S-T42、S-T92能够有效沉默RAW264.7细胞TLR4和TLR9的表达,且特异性好。我们选用S-T41、S-T91作为体内实验的siRNA。体外实验：在S-B和S-N组之间,所有结果均没有显著性差异（均P>>0.05）；在S-T4和S-T9组之间,除血清BUN浓度、TLR4表达外,所有结果均没有显著性差异（均P>0.05）。2小鼠生物学行为改变：Sham组与S-B、S-N组小鼠生物学行为改变基本同第二部分的sham组与CLP组；S-T4和S-T9组小鼠生物学行为改变程度轻于S-B和S-N组。3（1）血清Cr浓度：与sham组比较,S-B、S-N组6h血清Cr浓度均显著性升高（P<0.05）,12h、24h仍高于sham组,但无显著性差异（P>0.05）；与S-B、S-N组比较,S-T4、S-T9组6h血清Cr浓度均显著性降低（P<0.05）,在12h、24h时点没有显著性差异（P>0.05）,但仍低于S-B、S-N组,并至sham组水平（P>0.05）。各组组内比较各时间点均无显著性差异。（2）血清BUN浓度：与sham组比较,S-B、S-N组各时间点血清BUN浓度均显著性升高（P<0.05）,S-T4、S-T9组仅在6h浓度显著性升高（P<0.05）；与S-B、S-N组比较,S-T4、S-T9组各时间点浓度均显著性降低（P<0.05）,至24h,S-T9组浓度更是显著性低于S-T4组（P<0.05）。Sham、S-B、S-N、S-T4组组内比较没有显著性差异（P>>0.05）,S-T9组浓度进行性降低,各时间点之间均有显著性差异（P<0.05）。4肾组织病理损伤变化：各组肾组织病理损伤以细胞凋亡为主,未见细胞坏死现象。与sham组比较,S-B、S-N组各时间点肾组织病理损伤评分均显著增高（P<0.05）,6h时,S-T4组显著高于sham组,随后S-T4、S-T9组虽然高于sham组,但是没有显著性差异（P>0.05）。与S-B、S-N组比较,S-T9组各时间点均显著性降低（P<0.05）,S-T4组于12h、24h显著性降低（P<0.05）。各组组内均呈下降趋势,尤其在S-T4、S-T9组,24h显著性低于6h（P<0.05）。5凋亡相关变化：（1）与sham组比较,S-B、S-N组各时间点肾组织细胞凋亡率均显著性降低（P<0.05）,与S-B、S-N组相比较,S-T4、S-T9组均显著性降低（P<0.05）。S-B、S-N组肾细胞凋亡率进行性降低,24h显著性低于6h、12h（P<0.05）,余组组内比较没有显著性差异（P>0.05）。（2）TUNEL检测结果表明sham、S-T4、S-T9组凋亡细胞较少,S-B、S-N组细胞凋亡数明显增多,凋亡细胞主要见于肾皮质肾小管上皮细胞,肾小球少见。6 Caspase-3表达变化：（1） Caspase-3mRNA:与sham组相比较,SB、SN、S-T4、S-T9组caspase-3mRNA表达均显著性增高（P<0.05）分别升高5.21、5.03、2.83、2.69倍。与S-B、S-N组相比较,S-T4、S-T9组caspase-3mRNA表达均显著性降低（P<0.05）,较S-N组分别下降44%和47%。（2）免疫组化检查显示：Caspase-3蛋白主要表达于肾小管上皮细胞、肾小球血管内皮细胞胞质和胞核中。与sham组相比较,S-B、S-N组caspase-3蛋白表达均显著性增加（P<0.05）,与S-B、S-N组相比较,S-T4、S-T9组caspase-3蛋白表达均显著性降低（P<0.05）,与sham组相比较没有显著性差异（P>0.05）。7 TLR4表达变化：（1）与sham组相比较,S-B、S-N、S-T9组TLR4mRNA表达均显著性增高（P<0.05）,分别升高4.28、4.35、2倍。与S-B、S-N组相比较,S-T4、S-T9组TLR4mRNA表达均显著性降低（P<0.05）,较SN组分别降低89%和54%,S-T4组同时显著性低于sham组和S-T9组（P<0.05）。（2）免疫组化检查显示：蛋白主要表达于肾小管上皮细胞、肾小球血管内皮细胞胞质和胞核中。与sham组相比较,S-B、S-N组TLR4蛋白表达均显著性增加（P<0.05）,与S-B、S-N组相比较,S-T4、S-T9组TLR4蛋白表达均显著性降低（P<0.05）,与sham组相比较没有显著性差异（P>0.05）,虽然S-T4、S-T9组之间比较没有显著性差异,但结果显示S-T9组TLR4蛋白表达高于S-T4组。8存活率改变：S-B组与S-N组、S-T4组与S-T9组之间比较没有显著性差异（P>0.05）。sham组、S-B组、S-N组、S-T4组、S-T9组4天存活率分别为100%、40%、50%、80%、80%,7天存活率分别为100%、20%、30%、70%,80%。与sham组相比较,S-B组、S-N组4天、7天生存率较均显著性降低（P<0.05）。与S-B组、S-N组相比较,S-T4组、S-T9组4天存活率比较虽没有统计学差异（P>0.05）,但是存活率有明显改善；7天存活率,S-T9组存活率显著性增高,而S-T4组较S-N组有显著性差异（P=0.021,P<0.05）,但与S-B组没有显著性差异（P=0.075,P>0.05）。小结：1在体外实验,本部分实验中所设计、合成的TLR4/9 siRNA能够有效沉默小鼠巨噬细胞RAW264.7上TLR4/9的表达,且不存在非特异性沉默现象,证明我们所应用的小干扰RNA是有效的、特异的；2制模前24h尾静脉水动力注射法体内转导TLR4 siRNA质粒,能有效沉默肾组织TLR4的表达,证明此方法是一种有效的活体组织内转染siRNA的方法；转导TLR9 siRNA质粒后,同样有效沉默肾组织TLR4的表达,可能与减少TLR4的内源性配体有关；3尾静脉水动力注射法体内转导TLR4 siRNA,能够显著降低肾组织细胞凋亡,减轻肾组织病理损伤,改善肾功能及预后,可能与下调免疫细胞和/或肾实质细胞TLR4的表达有关；4尾静脉水动力注射法体内转导TLR9 siRNA,能够显著降低肾组织细胞凋亡,减轻肾组织病理损伤,改善肾功能及预后,可能与下调免疫细胞TLR9的表达有关；5TLR4/9 siRNA能够改善腹腔感染脓毒症AKI小鼠肾功能及预后,证明TLR4,9在其中起着关键作用。第五部分TLR4/9 siRNA预防性干预对脓毒症AKI小鼠炎症反应的影响目的：探讨Toll样受体4/9小干扰RNA对腹腔多菌感染脓毒症急性肾损伤小鼠炎症反应的影响和对脓毒症AKI的保护作用。方法：实验动物、分组与制模同第四部分。应用双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10方法,具体方法同第三部分。其他主要方法均同第四部分。结果：S-B, S-N组之间比较各时间点主要结果均无显著性差异（P>0.05）。1各组小鼠生物学行为及肾功能变化、肾组织病理损伤变化及肾组织TLR4mRNA、免疫组化变化均见第四部分实验结果。2血清TNF-α水平变化：与sham组相比较,S-B、S-N、S-T4和S-T9组各时间点血清TNF-α水平均显著性升高（P<0.05）。与S-B、S-N组相比较,S-T4和S-T9组组各时间点血清TNF-α水平均显著性降低（P<0.05）,S-T9组更是降低了S-T4组的水平（P<0.05）。Sham、S-B、S-N组组内比较均没有显著性差异（P>0.05）。S-T4和S-T9血清TNF-α水平逐渐降低,并于24h显著性低于6h和12h（P<0.05）。3血清IL-6水平变化：与sham组相比较,S-B, S-N, S-T4和S-T9组各时间点血清IL-6水平显著性升高（P<0.05）。与S-B, S-N组相比较,S-T4组各时间点血清IL-6水平均显著性降低（P<0.05）；S-T9组血清IL-6水平于12h、24h均显著性低于S-B、S-N、S-T4组（P<0.05）。各组组内血清IL-6水平均呈下降趋势,S-B、S-N组24h与6h、12h相比较均有显著性降低（P<0.05）S-T4、S-T9组内各时间点均有显著性差异（P<0.05）。4血清IL-10水平变化：S-T4和S-T9组间各时间点比较均没有显著性差异（P>0.05）与sham组相比较,S-B、S-N、S-T4和S-T9组各时间点血清IL-10水平显著性升高（P<0.05）,但是S-T4和S-T9组血清IL-10水平升高不如S-B和S-N组（P<0.05）。与S-B、S-N组相比较,S-T4、S-T9组12h、24h时间点血清IL-10水平均进一步显著性升高（P<0.05）。S-B、S-N组组内血清IL.10水平进行性下降,24h与6h、12h相比较均有显著性降低（P<0.05）,S-T4、S-T9组进行性上升,12h、24h均与6h有显著性差异（P<0.05）小结：1制模前24h分别尾静脉水动力注射法转导TLR4/9 siRNA质粒,均显著降低了脓毒症AKI血清中促炎介质TNF-α、IL-6浓度,进一步升高了血清中抗炎介质IL.10浓度,平衡了炎症反应；2 TLR4 siRNA对于多菌感染脓毒症AKI的肾保护作用可能是通过TLR4 siRNA下调了免疫细胞和/或肾实质细胞TLR4的表达而调整了促炎和抗炎之间的平衡达到的；3TLR9 siRNA对于多菌感染脓毒症AKI的肾保护作用可能是通过TLR9 siRNA下调了免疫细胞TLR9的表达而调整了促炎和抗炎之间的平衡达到的；4 TLR4/9 siRNA对于腹腔感染脓毒症AKI具有肾保护作用,证明TLR4,9在其中起着关键作用。综合上述五部分内容,本研究得出如下结论：1盲肠结扎穿孔术（CLP）能够成功制备腹腔多菌感染脓毒症AKI模型。2在CLP所诱导的AKI中,肾组织细胞凋亡是其主要病理生理特点；应用选择性caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO,能够降低肾组织细胞凋亡,改善肾功能及预后,进一步证明肾组织细胞凋亡在多菌感染脓毒症AKI发病机制中的重要作用；此为进一步研究脓毒症AKI发病机制及进行抗凋亡的临床研究提供了理论依据。3在CLP所诱导的AKI中,炎症反应是其主要发病机制之一,应用选择性caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO,即通过抗凋亡手段能够平衡炎症反应,此再次为进一步研究脓毒症AKI发病机制及进行抗凋亡的临床研究提供了理论依据。4脓毒症AKI时小鼠肾组织TLR4表达上调。尾静脉水动力注射法体内转导TLR4 siRNA,能够显著降低肾组织细胞凋亡、平衡炎症反应,减轻肾组织病理损伤,改善肾功能及预后,可能与下调免疫细胞和/或肾实质细胞TLR4的表达有关；尾静脉水动力注射法体内转导TLR9siRNA,能够显著降低肾组织细胞凋亡、平衡炎症反应,减轻肾组织病理损伤,改善肾功能及预后,可能与下调免疫细胞TLR9的表达有关,证明TLR4,9在多菌感染脓毒症AKI的发病机制中起着关键作用。siRNA技术、尾静脉水动力注射法能够成功沉默小鼠肾组织相关基因表达,为今后的TLRs基因干预治疗提供理论及动物实验依据。
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