新城疫病毒陕西分离株P基因进化分析及V基因真核表达

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）又名亚洲鸡瘟,是由新城疫病毒（Newcastle diseas virus,NDV）引起的禽类的急性、高度接触性、致死性传染病。该病在世界范围内广泛流行,是引起我国养禽业中经济损失的重要疾病之一。对ND的分子流行病学研究不仅能为防控ND提供指导,还能揭示NDV在我国的流行和进化,是目前研究ND流行病学的重要途径之一。对NDV基因功能的研究,不但有利于阐明NDV感染机体后机体的动态反应,而且可以为新型疫苗的研发提供基础。本研究克隆得到了这3株不同动物源NDV P基因序列,分析了P基因的变异及进化情况;用人工定点突变的方法以P基因为模板克隆到了3株病毒的V基因,用生物学分析工具分析了V蛋白的一级和二级结构特点;以PEGFP-C1为载体,构建了V基因真核表达质粒,摸索得到了V基因真核表达的条件,并对表达的产物进行了鉴定;主要研究内容如下:1、增殖了3株实验室保存的NDV,NnShX05、ChickenShX08、PigeonShX03,用TA克隆的方法得到了P基因的全长序列。比较了他们和Gene Bank上其他毒株的P基因序列,构建了遗传进化树。结果显示:NnShX05和参考毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为82.1%～99.8%和81.1%～100%;ChickenShX08和参考毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为82.1%～100%和81.1%～100;PigeonShX03和参考毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为82.4%～93.1%和79.1%～93.2%;NnShX05和ChickenShX08的核苷酸序列仅存在2个碱基的差异,他们和PigeonShX03序列差异较大;NnShX05和ChickenShX08均和EU296519.1TW06-316亲缘关系最远,和HB92 isolate V4亲缘关系最近,PigeonShX03和EU4199882.1D58亲缘关系最远,和EU296531.1TW84-P72亲缘关系最近。遗传进化分析表明:NnShX05和ChickenShX08可能来源于疫苗毒株,PigeonShX03由台湾毒株进化而来或是与其拥有共同的祖先。2以3株P基因克隆质粒为模板,运用大引物法进行人工定点突变,克隆得到了3株病毒的V基因。比较发现NnShX05和ChickenShX08 V基因只有一个核苷酸的差异,编码氨基酸序列完全相同;NnShX05、ChickenShX08 V基因核苷酸序列以及推导氨基酸序列和PigeonShX03差异较大。V蛋白结构预测表明:NnShX05和PigeonShX03 V蛋白的氨基酸组成个数相等、在相同的位点形成糖基化位点和Zn指结构,但是他们的氨基酸组成、等电点不同,且存在1个酰基化位点7个磷酸化位点的差异。结果表明:不同动物源NDV V蛋白拮抗干扰素能力可能不同。3、以PEGFP-C1为载体构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的V基因真核表达质粒。通过转染真核细胞,研究NDV V基因在体外真核细胞中的表达情况。结果显示NDV V基因能在Vero中较高效表达,Western-blotting鉴定表明,表达的蛋白有良好的反应原性,能和NDV抗血清发生特异性反应。为体外研究不同动物源NDV V蛋白拮抗干扰素能力的差异奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 新城疫病毒生物学特性及流行病学研究进展
• 1.1 新城疫
• 1.2 新城疫病毒的生物学特性
• 1.2.1 新城疫病毒的理化特性
• 1.2.2 新城疫病毒的基因组特性
• 1.2.3 NDV 的毒力测定
• 1.2.4 NDV 的复制
• 1.2.5 NDV 的生物学活性
• 1.2.6 NDV 的培养特性
• 1.3 NDV 的各个基因及蛋白功能
• 1.3.1 NP 基因及NP 蛋白功能
• 1.3.2 P 基因和P 蛋白的功能
• 1.3.3 M 基因及M 蛋白的功能
• 1.3.4 F 基因及F 蛋白的功能
• 1.3.5 HN 基因及HN 蛋白功能
• 1.3.6 L 基因及L 蛋白功能
• 1.4 新城疫的流行病学
• 1.5 小结
• 第二章 新城疫病毒陕西分离株P 基因克隆及序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试验仪器
• 2.1.2 主要试剂和耗材
• 2.1.3 病毒来源
• 2.1.4 鸡胚、阳性血清、宿主菌与载体
• 2.2 方法
• 2.2.1 常用试剂的配制
• 2.2.2 病毒的增殖
• 2.2.3 增殖病毒NDV 抗原的RT-PCR 检测
• 2.2.4 NDV P 基因的RT-PCR 扩增
• 2.2.5 NDV 分离株P 基因的克隆与鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 病毒分离鉴定结果
• 2.3.2 NDV 抗原的PCR 检测结果
• 2.3.3 NDV P 基因RT-PCR 扩增结果
• 2.3.4 PCR 产物的回收结果
• 2.3.5 菌液PCR
• 2.3.6 重组质粒的酶切鉴定结果
• 2.3.7 NDV 分离株P 基因遗传变异分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 NDV 陕西分离株V 基因克隆及V 蛋白结构预测
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试验仪器
• 3.1.2 主要试剂和耗材
• 3.1.3 宿主菌与载体
• 3.2 方法
• 3.2.1 常用试剂的配制
• 3.2.2 V 基因的PCR 扩增
• 3.2.3 V 基因的克隆与鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 PCR 扩增结果
• 3.3.2 PCR 产物的回收结果
• 3.3.3 菌液PCR
• 3.3.4 重组质粒的酶切鉴定结果
• 3.3.5 NDV V 基因测序结果分析
• 3.3.6 V 蛋白以及结构预测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 NDV V 基因真核表达研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试验仪器
• 4.1.2 主要试剂和耗材
• 4.1.3 宿主菌与载体
• 4.2 方法
• 4.2.1 常用试剂的配制
• 4.2.2 NDV V 基因真核表达质粒的构建
• 4.2.3 阳性质粒的大量提取
• 4.2.4 细胞的转染
• 4.2.5 转染后细胞的收集
• 4.2.6 V 蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 4.2.7 V 蛋白真核表达的Western Blotting 检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 V 基因真核表达载体构建
• 4.3.2 质粒大量提取结果
• 4.3.3 细胞转染结果
• 4.3.4 V 蛋白SDS-PAGE 和Western Blotting 检测结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 英文缩略词及中英文对照表
• 致谢
• 作者简介