论文摘要
背景：HIV病毒引起的艾滋病（AIDS）是一种全球性疾病，蔓延速度快，死亡率高。目前临床上抗HIV治疗药物昂贵、不良反应多，且只能起到延缓艾滋病发生的作用。因而研制有效的艾滋病疫苗则是控制AIDS流行甚至根除AIDS的理想而可行的途径。近年来活载体疫苗由于其能产生明显的免疫反应，受到了许多研究人员的重视。利用缺陷性脊髓灰质炎病毒作为载体，将艾滋病病毒核心蛋白基因gag，多聚酶基因pol进行重组并与脊髓灰质炎病毒载体链接，得到含艾滋病病毒基因的重组脊髓灰质炎病毒，能够诱导系统性的体液免疫与细胞免疫反应，有很大的应用前景。目前国内还未见用脊髓灰质炎病毒表达载体构建HIV重组疫苗的正式报道。目的：为了能够有效的预防和治疗艾滋病，为将来真正应用于临床的HIV疫苗提供实验基础，本研究以缺陷性脊髓灰质炎病毒为载体，插入HIV—1 gagpol基因，构建含gagpol基因的重组缺陷性脊髓灰质炎疫苗，并研究其表达、形态及是否可引起免疫反应。方法：1、含HIV—1 gagpol基因的重组缺陷脊髓灰质炎病毒表达载体的构建：选择HIV—1B亚型代表毒株，以质粒pT7gagpol为模板，将其插入缺少VP1及VP4段基因的脊髓灰质炎病毒表达载体pSVA14中，构建重组脊髓灰质炎病毒表达载体，并对其进行PCR、内切酶鉴定。2、HIV—1 gagpol基因表达的检测：（1）用脂质体转染技术将重组质粒转染A549细胞，G418进行压力筛选得到转入重组缺陷脊髓灰质炎病毒表达载体的细胞株A549-gagpol，RT-PCR和免疫酶法检测混合细胞系中HIV-1 gagpol基因的表达，鉴定是否有目的基因的插入。（2）将重组缺陷脊髓灰质炎病毒感染293细胞，采用Western blot方法检测重组缺陷脊髓灰质炎病毒能否感染细胞并表达目的基因。3、重组缺陷脊髓灰质炎病毒形态学鉴定：通过重组痘苗病毒提供缺陷性脊髓灰质炎病毒的衣壳蛋白，组装重组脊髓灰质炎病毒完整颗粒，并通过氯仿一PEG／NaCL一氯仿三步法纯化重组脊髓灰质炎病毒，电镜下观察重组病毒形态。4、重组缺陷脊髓灰质炎病毒的遗传稳定性分析：将重组脊髓灰质炎病毒感染的293细胞连续培养传代检测疫苗的安全性及遗传稳定性。结果：1、构建重组HIV—1 gagpol基因脊髓灰质炎病毒通过PCR，酶切鉴定证实HIV-1 gagpol基因片断正确的插入到脊髓灰质炎病毒载体。2、RT-PCR的方法检测到HIV-1 gagpol基因在含重组脊髓灰质炎病毒表达载体的细胞系A549-gagpot中可以有效的转录；通过免疫酶法可以检测到细胞系中HIV-1gagpol的表达；Western blot方法检测到重组脊髓灰质炎病毒能感染细胞并表达目的基因。3、电镜观察重组病毒颗粒呈直径20-30nm的对称二十面体，具有典型的脊髓灰质炎病毒颗粒形态。4、重组脊髓灰质炎病毒疫苗具有安全性及遗传稳定性。结论：1、首次构建了表达HIV-1 gagpol基因片段的重组脊髓灰质炎病毒表达载体，使用缺陷性脊髓灰质炎病毒表达载体表达结构基因和早期基因的一个明显优势是可以引起较强及长久稳定的免疫反应，为重组脊髓灰质炎病毒疫苗的研究应用奠定了基础。2、重组病毒能正确的表达gagpol基因，并能感染人正常细胞，刺激人正常细胞产生免疫反应。
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标签：重组脊髓灰质炎病毒论文; 疫苗论文;