H5N1亚型禽流感病毒致病特征、HA、NA基因的克隆、序列分析及重组病毒疫苗株构建的研究

论文摘要

高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI）呈世界性分布，危害极大，常呈毁灭性的爆发，国际兽疫局将其划定为A类传染病，并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。许多家禽和野禽、鸟类都对高致病性禽流感病毒敏感。候鸟、观赏鸟、水禽等携带病毒迁徒可能是禽流感世界性流行的主要原因。另外，猪等哺乳动物也可传播本病，因而增加了流感控制的难度。除此之外，禽流感病毒血清学亚型众多，变异性强，存在抗原漂移和抗原转变，不同亚型病毒的差异很大，即使相同亚型的不同分离株病毒的差异也很大，而且能够跨越种间屏障感染。近年来HPAI不断侵袭整个世界，引起各国高度重视。基于高致病性禽流感流行态势，本论文开展了HPAIV致病力的生物学特性研究并对HPAIV HA及NA基因进行了克隆、测序、测序和遗传演化分析，同时还开展H5N1亚型流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒活载体疫苗毒株的研究。主要研究内容包括：1．H5N1亚型禽流感病毒分离株致病力的生物学特性研究本研究以水禽及鸡分离出H5N1亚型AIV为研究对象，从病毒致病性的不同层次包括个体水平、细胞水平及分子水平系统研究H5N1 AIV致病力的生物学特征，为高致病性禽流感的预测、监控、防制提供科学依据及对策。整体水平的致病性研究以本地分离的一株鹅源H5N1 AIV（ZFE株）为材料进行了致病性研究。结果表明该毒株EID50为10-9.8／0.1mL，IVPI=228／80=2.85，ICPI=240／80=3.00，对鸡攻毒后36h全部发病并100％死亡，临床症状及病理变化等致病特点均反映了分离的水禽禽流感病毒株对鸡有较强的毒力及致病力，同时也提示水禽不仅是AIV的贮存宿主并能引起HPAI爆发流行。H5N1 AIV攻毒猪主要表现呼吸道症状及典型的肺炎病理变化，攻毒后28天血清OD值在0.5以上呈ELISA反应阳性，初步表明H5N1亚型AIV对猪有感染性。对细胞致病特点的研究本研究用电子显微镜观察到分离的HPAIV感染MDCK细胞典型的凋亡形态学变化，表现为细胞体积缩小，核固缩，细胞膜内陷，形成凋亡小体，线粒体区域化等变化。通过不同时相（0、6、12、18、24、30h）的连续动态观察过程，发现了禽流感病毒诱导细胞凋亡最早发生在病毒感染后12h，DNA梯状条带出现的早期凋亡生化特征也发生在12h，而此时在普通倒置显微镜下未观察到CPE。说明在体外细胞出现明显的病变前，细胞已开始启动凋亡机制。受H5N1亚型AIV攻击易感鸡病变的脾、脑组织细胞呈棕色强阳性TUNEL染色，说明了AIV对脾、脑组织的广泛亲嗜性。引起脾细胞凋亡可能与HPAIV直接作用于脾淋巴细胞诱导其凋亡有关，由于淋巴细胞凋亡，导致免疫抑制，造成免疫器官损害和宿主对流感病毒感染缺乏抵抗力。组织细胞病理学观察主要表现为：肺结缔组织增生，肝组织血管淤血，肝细胞坏死、脂肪变性，脾脏、肾脏充血、出血、变性坏死，脑组织淤血、坏死，神经细胞坏死出现嗜神经的现象，心肌出血坏死，心肌纤维断裂。表明分离毒株对鸡体的组织细胞具有广泛的组织亲嗜性。HSN1亚型AIV的分子致病特点的研究对分离株AIV HA基因的核苷酸序列分析比较发现：HA全基因翻译的HA蛋白氨基酸裂解位点序列（341-347位）为R-R-R-K-K-R↓G，有6个以上连续的碱性氨基酸。分析结果证明了分离株具有高致病性禽流感病毒的分子致病特征。2．H5N1亚型禽流感病毒HA、NA基因的克隆及序列分析本研究对2003年末至2004年春禽流感爆发流行期间分别从鸡、鸭、野鸭、大雁鹅病料分离出的5株AIV的HA及NA基因进行克隆、序列分析，并根据其核苷酸序列进行遗传演化分析，同时与越南、泰国、印尼及我国香港、广东、广西、上海、山东等地水禽、鸡及猪H5N1 AIV参考序列进行了比较，目的是了解本地区H5亚型HPAIV在基因水平遗传演化特征与分子流行病学规律，对预测H5N1禽流感流行的可能性和发展趋势提供依据。本研究克隆的5株AIV本地分离株HA基因cDNA片段的全长均为1707bp，编码568个氨基酸残基，有完整的读码框。克隆的5株AIV本地分离株NA基因cDNA片段的全长均为1350bp，编码449个氨基酸残基，有完整的读码框。HA基因核苷酸序列比较分析表明，2004年从湖北分离的4株病毒之间同源性最高，为99.6％～99.9％，遗传路径大体相似，具有较近的亲源关系并均由1株大雁鹅源AIV HA基因演化而来。证实疫源地内水禽是传播H5N1 AIV的主要来源。湖北鸭中分离的1株XFY AIV进化速度较慢，但建立的遗传进化树上的所有毒株均由它演化发展而来，是所分析毒株的共同祖先，其HA蛋白氨基酸信号肽序列、HA1、HA2序列有多处位点发生突变，意味着该毒株在流行病学上的重要意义。山东猪及广东鹅2株H5N1 AIV HA基因型派生至吉林鸡AIV进而演化出湖北及东亚两大枝系，显示猪在“禽-猪-人”的种间传播链中，扮演着流感病毒中间宿主和混合器的作用。越南人源H5N1 AIV HA基因的进化经历了不同路径，以较快的速率到达人类，给人类造成巨大威胁。该病毒与湖北分离的5株H5N1 AIV同源性较低而且近期的演化路径也不同，说明它们之间可能无直接的关系。从NA基因分子进化分析还表明2004年泰国分离的1株鹌鹑及1株人的H5N1 AIV与我国广西鸭H5N1 AIV同源性最低，仅为95.6％，与湖北6株地方分离株的同源性为97.3～97.9％，与我国其它禽流感病毒的同源性也较低，因而可以看出泰国鹌鹑流感及禽源人流感病毒与我国禽流感病毒之间亲源关系均较远。从基因的遗传进化树分析还可以看出，AIV NA基因经历了来源于鸭又回归于鸭的演化过程。进一步证明水禽已不再是仅仅作为AIV的巨大贮存库，其本身已对禽流感病毒高度易感并构成传播的重要来源。遗传演化分析表明，2004年4株地方分离株（JZJ、ZFE、TMJ、XFY）H5N1 AIV NA基因与我们在2002年分离株（DW）同在一枝系，其同源性为99.7～99.9％。分离株（XFJ、JZJ、TMJ、ZFE）H5N1 AIV HA基因与DW株同在一枝系，其同源性为99.6～99.9％，具有较近的亲源关系，表明2002年和2004年湖北流行的H5N1亚型高致病性禽流感病毒在分子水平基本上没有变化。3．H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒活载体疫苗毒株构建的研究本研究将H5N1 AIV主要免疫原性基因HA插入PRV Ea TK-／gE-／gI／-LacZ+亲本株，成功地构建了H5N1亚型流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒活载体疫苗毒株。伪狂犬病毒疫苗载体的本身用于控制伪狂犬病，同时因插入了免疫原性基因HA片段后，诱导机体产生针对AIV的特异性免疫反应。本项研究在阻止HSN1 HPAIV在猪这一中间宿主的传播具有重要意义，为预防HPAIV感染猪提供技术储备，目前该研究在国内外均未见报道。本试验将H5N1 AIV HA全基因克隆到转移载体pIECMV中，与亲本株PRV TK-／gE-／gI-／LacZ+的基因组共转染IBRS-2细胞，构建了HSNl AIV HA基因重组伪狂犬病毒TK-／gE-／gI-／HA+疫苗毒株。Western-blot表明重组病毒HA糖蛋白在IBRS-2细胞中获得表达，所表达的HA糖蛋白裂解为具有感染性的HA1和HA2条带，这两条带都具有与多克隆抗体结合的能力。免疫荧光染色检测重组病毒表达的HA糖蛋白与HA单克隆抗体结合后显示出强阳性亮绿色荧光，表明HA蛋白主要存在于被感染的IBRS-2细胞膜上。结果证实伪狂犬病毒表达的HA蛋白不仅抗原性和病毒感染宿主细胞合成的糖蛋白结构特征相同，而且存在的部位也完全一样。制备流感疫苗必备的条件之一是疫苗毒株应具有良好的生长特性，本研究构建的TK-／gE-／gI-／HA+重组病毒株，在IBRS-2传代细胞系上测得的TCID50为10-7.80／0.1mL，表明HA基因插入PRV载体不影响亲本株病毒毒价。重组病毒疫苗毒株免疫小鼠抗体检测结果显示，经二免后第7天，重组病毒抗AIV ELISA抗体出现阳转，平均OD630值为0.77。亲本株、PBS空白对照小鼠未检测到抗HA的ELISA抗体。表明插入HA基因重组病毒可诱导小鼠机体产生抗AIV抗体。间接ELISA检测血清样品抗PRV抗体水平发现首免后18天，重组病毒及亲本毒株免疫鼠抗PRV抗体出现阳转，到二免后第7天，重组病毒免疫鼠及亲本株对照组抗PRV ELISA抗体平均值分别升高至1.49及1.50，但AIV灭活疫苗对照组及PBS空白对照组小鼠均未检测到抗PRV的ELISA抗体。说明HA基因插入载体病毒不影响伪狂犬病毒免疫的抗体水平。本研究对如何防制猪感染高致病性禽流感做了探索性的研究。结果初步表明该疫苗毒株免疫小鼠，可产生针对禽流感病毒及伪狂犬病毒的抗体。有关HA基因体内表达的检测、体液免疫及细胞免疫水平的评价及免疫效果还有待于深入研究。

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中文摘要

Abstract

第1章文献综述

1 流感的流行史及流行动态

1.1 人流感的流行

1.2 禽流感的流行

2 流感病毒结构及其致病特点

2.1 HA的结构对致病力的影响

2.2 NA结构对致病力的影响

2.3 禽流感病毒致病性与病毒的组织趋向性

3 流行病学、生态学及其公共卫生学意义

3.1 流行病学及分子流行病学的概念

3.2 流感病毒在流行病学上的特点

3.3 流感病毒生态学特点

3.4 流感病毒的公共卫生学意义

3.4.1 禽流感病毒的公共卫生学意义

3.4.2 猪流感病毒的公共卫生学意义

3.5 流行因素分析

4 流感的发病机制

4.1 流感病毒变异的机理

4.1.1 抗原性漂移

4.1.2 抗原性转变

4.2 流感病毒诱导细胞凋亡

5 禽流感的临床症状及病理变化

5.1 临床症状

5.2 病理变化

5.2.1 病理剖检变化

5.2.2 病理组织学变化

6 诊断

6.1 病原分离

6.2 血清学检查

6.2.1 琼脂扩散试验

6.2.2 血凝和血凝抑制试验

6.2.3 ELISA技术

6.3 分子诊断技术

6.3.1 RT-PCR分子诊断技术

6.3.2 核酸探针技术

6.3.3 基因芯片技术

7 流感的防治

7.1 禽流感的免疫预防

7.1.1 国外使用灭活疫苗的状况

7.1.2 我国使用灭活疫苗的状况

7.1.3 新型流感疫苗的发展

7.2 防治药物

7.2.1 金刚烷胺（Amantadine）和甲基金刚烷胺（Rimantadine）

7.2.2 病毒唑（Virazole）

7.2.3 神经氨酸酶抑制物（Neuramindase inhibitors）

7.3 防治禽流感应有的对策

7.3.1 改变传统的思维模式

7.3.2 改变传统的养殖方式

7.3.3 加强对候鸟的防控

7.3.4 长期的监测及预警预报体系

7.3.5 主动的疫情报告及保障体系建立的必要性

第2章 H5N1亚型禽流感病毒分离株致病力的生物学特性研究

1 研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 SPF鸡胚及试验动物

2.1.2 抗原与抗体

2.1.3 酶与试剂

2.1.4 主要培养基

2.1.5 病毒及细胞

2.1.6 引物设计与合成

2.2 方法

2.2.1 血清学鉴定

2.2.2 分离病毒的有限稀释克隆纯化

2.2.3 病毒增殖

2.2.4 致病性试验

50测定'>2.2.5 TCID₅₀测定

2.2.6 组织病理学观察

2.2.7 病毒粒子的形态学

2.2.8 细胞凋亡的形态学

2.2.9 细胞凋亡的生化特征观察

2.2.10 HA基因的克隆及HA蛋白裂解位点分析

3 结果与分析

3.1 血清学鉴定

3.2 分离病毒的有限稀释克隆纯化

3.3 病毒感染力

50测定'>3.3.1 EID₅₀测定

3.3.2 IVPI测定

3.3.3 ICPI测定

50测定结果'>3.3.4 TCID₅₀测定结果

3.4 动物致病力试验结果

3.4.1 对鸡致病力试验

3.4.2 对猪致病力

3.5 病毒粒子的形态学观察

3.6 发病鸡组织病理学观察

3.7 DNA断裂的原位末端标记结果

3.8 细胞凋亡电镜下形态学观察

3.9 DNA片段化（DNA ladder）分析

3.10 HA基因蛋白酶切割位点氨基酸序列分析

3.10.1 RT-PCR扩增结果

3.10.2 HA基因的克隆、鉴定及测序

3.10.3 HA基因裂解位点氨基酸序列

4 讨论

4.1 整体水平的致病性研究

4.2 H5N1 AIV对细胞致病特点的研究

4.3 H5N1亚型AIV的分子致病机理

5 小结

第3章 H5N1亚型禽流感病毒HA、NA基因的克隆及序列分析

1 研究目的和意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 病毒株

2.1.2 菌株及质粒

2.1.3 酶及主要试剂

2.1.4 质粒抽提相关溶液

2.1.5 LB培养基

2.2 方法

2.2.1 病毒的增殖

2.2.2 病毒RNA的提取

2.2.3 HA、NA基因的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

2.2.4 HA、NA全基因的cDNA的克隆

2.2.5 阳性重组质粒的筛选与鉴定

2.2.6 核苷酸序列测定及分析

3 结果与分析

3.1 HA、NA基因RT-PCR产物的扩增

3.2 HA、NA重组质粒PCR扩增产物的克隆与鉴定

3.2.1 HA基因cDNA的克隆与鉴定

3.2.2 NA基因cDNA的克隆与鉴定

3.3 HA、NA基因核苷酸序列测定及分析

3.3.1 HA基因核苷酸序列测定及分析

3.3.2 NA基因核苷酸序列测定及分析

4 讨论

4.1 核苷酸序列测定及分析

4.2 HA基因的变异特点

4.3 NA基因的变异特点

4.4 HA基因同源性及分子进化分析

4.5 NA基因同源性及分子进化分析

5 小结

第4章 H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒重组活载体疫苗毒株构建的研究

1 研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 毒株与细胞

2.1.2 菌种与质粒

2.1.3 主要药品及试剂

2.1.4 单克隆抗体

2.1.5 主要培养基

2.1.6 血清

2.1.7 缓冲液

2.1.8 其它缓冲液

2.1.9 试验鼠

2.2 方法

2.2.1 病毒的增殖

2.2.2 病毒基因组的提取

2.2.3 AIV-HA基因的克隆

2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.5 HA基因与pCDNA3.1载体连接

2.2.6 连接产物的转化

2.2.7 质粒的小量制备（碱裂解法）

2.2.8 重组质粒pCD-HA的鉴定

2.2.9 重组转移质粒pIECMV-HA的构建及鉴定

2.2.10 质粒的大量制备（碱裂解法）

2.2.11 共转染

2.2.12 空斑筛选纯化

2.2.13 PCR检测外源基因在重组病毒中的整合

50的测定'>2.2.14 重组病毒TCID₅₀的测定

2.2.15 SDS-PAGE电泳

2.2.16 Western blot

2.2.17 间接免疫荧光法检测

2.2.18 小鼠分组及免疫

2.2.19 间接ELISA抗体检测

3 结果与分析

-／gE^-／gI^-／HA⁺的构建'>3.1 H5N1 AIV HA基因重组伪狂犬病毒TK^-／gE^-／gI^-／HA⁺的构建

3.1.1 H5N1亚型禽流感病毒HA基因的克隆

3.1.2 重组质粒pCD-HA的鉴定

3.1.3 含AIV HA基因的转移质粒pIE-HA的构建与鉴定

-／gE^-／gI^-／HA⁺的空斑筛选与纯化'>3.2 重组病毒TK^-／gE^-／gI^-／HA⁺的空斑筛选与纯化

-／gE^-／gI^-／HA⁺的Western blot鉴定'>3.3 重组病毒TK^-／gE^-／gI^-／HA⁺的Western blot鉴定

3.4 间接免疫荧光法检测结果

3.5 重组病毒在细胞上的增殖滴度

-／gE^-／gI^-／HA⁺免疫小鼠抗HA的ELISA抗体检测'>3.6 重组病毒TK^-／gE^-／gI^-／HA⁺免疫小鼠抗HA的ELISA抗体检测

4 讨论

5 小结

参考文献

缩略词

附录

致谢

H5N1亚型禽流感病毒致病特征、HA、NA基因的克隆、序列分析及重组病毒疫苗株构建的研究

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