Pfu高保真酶结合双硫代修饰引物在全血基因分型检测中的应用

论文摘要

目的:利用Pfu高保真DNA聚合酶结合双硫代磷酸化修饰引物,建立能准确和敏感识别SNP突变位点方法。建立高特异性全血快速基因分型检测技术,应用该技术进行临床华法林用药剂量相关的两个位点基因检测。方法:阅读国内外相关文献,查找到主要造成大陆汉族人群华法林用药剂量个体化差异的两个相关基因,分别是VKORC1基因和CYP2C9基因;在NCBI Gene数据库中查找到VKORC1和CYP2C9的基因序列,同时根据NCBI OMIM数据库中所列出的以及文献中所报道的关于这两个位点的遗传多态性的主要特征,明确了其SNP突变位点所在序列中的位置;克隆出含目的SNP位点的DNA片段,通过定点突变得到SNP位点的两个等位基因型,并以此构建重组质粒作为研究模板;设计多对SNP突变位点检测引物,进行大量和重复的实验来测试所设计的检测引物的特异性;将得到的最佳检测引物应用于对基因组DNA的SNP分析;优化PCR的反应和扩增条件,同时加入防PCR产物污染体系,开展研究以全血为检测对象的快速基因分型检测新方法。结果:明确其目的基因序列以及目的基因SNP位点所在位置;克隆出了含目的SNP位点的DNA片段,并且定点突变得到了相应SNP位点的突变基因型;构建出了含有目的基因的野生型重组质粒和突变型重组质粒;鲑鱼精DNA(SalmonDNA)在质粒检测系统中具有很重要的作用,在10pg的质粒浓度下,25μl的质粒检测系统中加入50ng的SalmonDNA能达到准确和真实测试检测引物的效果;Pfu高保真DNA聚合酶结合3’次末端不配对的双硫代修饰引物能增加SNP位点识别特异性;优化PCR反应条件时我们摸索到最佳的基因组检测体系包含20ng的DNA模板量和0.75U的Pfu聚合酶量;采用Touchdowm PCR方法可以在得到大量特异性产物的同时还避免了非特异产物的出现;使用定点突变方法得到了突变型Pfu高保真酶能应用dUTP为底物进行PCR扩增反应,同时用含有dUTP的反应原料与尿嘧啶糖苷酶(UNG酶)结合,构成了防PCR产物污染体系;在防污染体系的基础上我们建立了高特异性全血快速基因分型检测技术,3小之内就可以实现SNP位点基因型分析,并把该技术成功地应用到临床华法林用药剂量相关两个基因位点的检测上来;发现8%全血,镁离子浓度3mM时PCR扩增效率高且特异性好,而抗凝剂种类对PCR扩增效率和特异性没有影响。结论:成功地构建含目的基因片段的TA克隆载体;在质粒检测系统中加入Salmon DNA后显著提高了基因型特异性引物优化的效率和准确性,成功地将得到的最佳检测引物应用于对基因组DNA以及全血的SNP分析;成功地建立以人类基因组DNA为模板的能准确和敏感识别基因SNP突变位点的方法;成功地建立防PCR产物污染体系,并在防污染体系的基础上开创性地建立了以人类全血为模板的能准确、敏感、快速识别基因SNP突变位点的创新方法;建立高特异性全血快速基因分型检测技术,并申请国家专利,开发出个体化用药相关基因检测试剂盒。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 一、研究背景
• 二、本课题的创新点
• 研究材料
• 一、实验标本
• 二、主要试剂
• 三、实验仪器
• 研究方法
• 一、文献检索与研究
• 二、实验操作基本方法
• 第一部分 高保真聚合酶结合修饰引物实现SNP 分析的体系建立
• 引言
• 第一节 比较不同高保真聚合酶和不同引物修饰及酶和模板浓度对SNP 分析的影响
• 材料和方法
• 实验结果
• 小结
• 第二节 质粒检测系统中加入 Salmon DNA 可以明显提高 AS-PCR 方法 中 SNP 位点识别的特异性
• 材料和方法
• 实验结果
• 小结
• 实验总结
• 第二部分 Pfu 高保真聚合酶介导的SNP 位点基因分型检测方法的建立
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 小结
• 第三部分 Pfu高保真聚合酶介导的高特异性快速全血SNP位点基因分型检测方法的建立
• 引言
• 第一节 UNG-dUTP 防PCR 产物污染体系的建立
• 材料和方法
• 结果
• 小结
• 第二节 全血检测SNP 位点的影响因素分析以及高特异性快速全血SNP 位点基因分型检测技术的建立
• 材料和方法
• 结果
• 小结
• 讨论
• 一、逐一分析了AS-PCR 在检测SNP 基因分型中产生假阳性的影响因素
• 二、质粒检测系统中加入Salmon DNA 可以准确和可靠地筛选出最佳检测引物
• 三、在防PCR 产物污染体系的参与下全血检测SNP 位点方法的建立
• 结论
• 参考文献
• 附录1：发明专利申请公布说明书
• 英文缩写词表
• 攻读学位期间发表的论文、科研成果
• 致谢