Ⅰ型菌毛对鼠伤寒沙门氏菌体内侵袭能力的影响

论文摘要

沙门氏菌（Salmonella）为肠杆菌科沙门氏菌属成员，是一类条件性细胞内寄生的革兰氏阴性肠杆菌，血清型众多，是人与动物的重要致病菌。沙门氏菌菌毛是细菌表面的纤细结构，与细菌粘附上皮细胞及在小肠粘膜定植有关。Ⅰ型菌毛是静止培养时唯一表达的菌毛，其结构与功能是各种菌毛中研究最为清楚的一种。前期体外研究证明，沙门氏菌Ⅰ型菌毛与细菌粘附与侵袭宿主细胞有关。本研究在此基础上，进一步体内研究，以小鼠为模型，通过LD50与侵袭试验，证实鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细胞毒力的影响。本研究针对沙门氏菌Ⅰ型菌毛进行的研究主要有以下几个方面：1．把质粒稳定系统hok-aphA-parDE成功克隆到能表达沙门氏菌Ⅰ型菌毛的pACYC184载体上，经测序确定hok-aphA-parDE序列与GenBank上公布的相应序列具有100％的同源性。测定了质粒稳定系统hok-aphA-parDE对质粒稳定性的作用。结果显示，没有质粒稳定系统的质粒在细菌培养12-24h后开始丢失，而含稳定系统的质粒在连续培养10代或120h都未发生丢失。这证明aphA-hok-parDE序列显著增强了质粒的稳定性。2．用半数致死量(LD50)检测沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细菌毒力的影响。把能表达沙门氏菌Ⅰ型菌毛的质粒和不能表达沙门氏菌Ⅰ型菌毛的质粒同时转入已经缺失了invA基因、lpfC基因和Ⅰ型菌毛fim基因的鼠伤寒沙门氏菌中，同时测定这两种细菌的LD50。结果显示，能表达沙门氏菌Ⅰ型菌毛的细菌毒力显著下降，其半数致死量较不能表达沙门氏菌Ⅰ型菌毛的细菌高76倍。3．把能表达沙门氏菌Ⅰ型菌毛的细菌和不能表达沙门氏菌Ⅰ型菌毛的细菌等量混合后对BALB／c小鼠灌胃接种，不同时间段扑杀小鼠，以细菌计数法检测血液，PPS（派伊尔氏结），肠系膜淋巴结，肝脏和脾脏各器官中这两种细菌的数目，从而揭示了沙门氏菌Ⅰ型菌毛在细菌体内侵袭中所起的作用，同时电揭示了细菌在体内扩散的相关规律。经过多次重复试验显示，能表达沙门氏菌Ⅰ型菌毛的细菌侵袭能力相对较差。同时在侵袭实验中，取小鼠的脾脏进行处理，用流式细胞术检测沙门氏菌和树突状细胞的相互作用。总之，本研究阐明了沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细菌体内侵袭能力的影响，为设计更加安全高效的弱毒沙门氏菌疫苗载体及有效防制人畜重要传染病提供了理论与实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 1 文献综述
• 1.1 沙门氏菌的特征及对人畜的危害
• 1.2 沙门氏菌的菌毛
• 1.2.1 沙门氏菌菌毛的分类
• 1.2.2 沙门氏菌菌毛在细菌致病中的作用
• 1.2.3 沙门氏菌菌毛抗原的应用
• 1.2.3.1 用于诊断试验
• 1.2.3.2 用于疫苗研制
• 1.3 沙门氏菌Ⅰ型菌毛与树突状细胞的相互作用
• 1.3.1 树突状细胞
• 1.3.2 两者的相互作用
• 1.4 质粒稳定系统
• 2 研究目的和意义
• 2.1 为防制人畜沙门氏菌病提供理论依据
• 2.2 为设计更加安全高效的弱毒沙门氏菌疫苗载体及有效防制人 畜重要传染病提供理论与实验依据
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 质粒、菌株及抗体
• 3.1.2 实验用培养基及其配制
• 3.1.3 各种酶、试剂盒及常用试剂
• 3.1.4 质粒抽取液及其他缓冲液
• 3.1.5 本实验所用的PCR引物
• 3.1.6 实验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 质粒的制备
• 3.2.2 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.4 连接产物的转化
• 3.2.5 重组质粒的鉴定
• 3.2.6 沙门氏菌电转化
• 3.2.7 细菌计数
• 3.2.8 质粒pAZ44-h的构建
• 3.2.9 细菌平板计数测定pAZ44-h和pAZ33-h的质粒稳定性
• 50))'>3.2.10 细菌对小鼠的急性毒性实验(半数致死量(LD₅₀))
• 3.2.11 细菌在小鼠体内各器官的动态分布及与DC细胞的相互作用
• 4 结果与分析
• 4.1 插入质粒稳定系统载体的构建与鉴定
• 4.1.1 aphA-hok-parDE序列的扩增
• 4.1.2 质粒pAZ44-aphA-hok-parDE（pAZ44-h）的鉴定
• 4.2 平板计数测定质粒稳定性
• 4.3 细菌对小鼠的急性毒性试验
• 4.4 细菌在小鼠体内各器官的动态分布
• 4.5 流式细胞术分析沙门氏菌与树突状细胞相互作用的结果
• 5 讨论
• 5.1 沙门氏菌与菌毛
• 5.2 树突状细胞在沙门氏菌感染与免疫中的作用
• 50的差异'>5.3 表达Ⅰ型菌毛与不表达Ⅰ型菌毛沙门氏菌LD₅₀的差异
• 5.4 影响侵袭试验结果重复性的原因
• 5.5 关于质粒稳定系统
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢