论文摘要
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。其确切的病因及发病机理至今尚不十分清楚。近年来的研究结果表明T细胞DNA甲基化异常在SLE发病中起十分重要的作用。DNA甲基化是表观遗传学的重要调节机制。基因调节序列甲基化抑制基因转录,而低甲基化则激活基因转录。已有研究表明在体外抑制T细胞DNA甲基化,使T细胞甲基化敏感基因调控序列特定区域低甲基化,从而导致基因过度表达。这些基因包括CD11a（ITGAL）、perforin（PRF1）、CD70（TNFSF7）及CD40 ligand（TNFSF5）。过度表达这些基因的T细胞具有自身反应性,杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量的自身抗体,在动物体内能诱导狼疮样疾病。而且上述甲基化敏感基因在SLE患者CD4+T细胞过度表达,基因调控序列特定区域甲基化水平低下,处于低甲基化状态。因此,SLECD4+T细胞的自身反应性与基因调控序列低甲基化密切相关。目前虽然DNA甲基化转甲基酶机制研究得比较清楚,但是DNA去甲基化的功能和机制仍然属于生物学倍受争议的研究领域。最新的研究结果显示Gadd45a（Growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45 alpha,即生长停滞与DNA损伤诱导蛋白）可通过促进DNA修复,去除甲基化标记,从而减少表观遗传基因的沉默。紫外线照射可以诱导Gadd45a表达上调,同时紫外线照射可诱发和加重SLE发病,SLE患者T细胞基因组DNA甲基化水平降低。因此,我们提出SLE发病机理之一可能为:核蛋白Gadd45a过度表达→阻抑T细胞基因调控序列甲基化→T细胞甲基化敏感基因过度表达→杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量自身抗体→SLE。这一假定的发病机制将通过三个部分的研究来证实:1.Gadd45a在SLE CD4+T细胞中的表达及与自身免疫的关系;2.紫外线对Gadd45a表达和甲基化水平的影响;3.诱导或抑制Gadd45a的表达对正常人CD4+T细胞或SLE CD4+T细胞甲基化敏感基因的表达、调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响;通过这些研究将进一步揭示导致SLE T细胞基因病理性低甲基化及自身免疫反应的关键环节和分子机制,为SLE治疗寻找有效的新途径提供理论依据。第一部分SLE患者CD4+T细胞Gadd45a的表达目的:探讨Gadd45a在SLE CD4+T细胞中的表达及与自身免疫反应的关系。方法:采用Real-time RT-PCR、Western blotting的方法分别从mRNA及蛋白水平检测17例SLE患者和10例正常人CD4+T细胞中Gadd45a基因的表达,同时检测细胞基因组DNA总体甲基化水平,并分析二者之间的相关性及其与疾病活动性评分（SLEDAI）的相关性。结果:和正常人比较,SLE患者CD4+T细胞Gadd45a mRNA和蛋白水平均显著升高（P＜0.01或P＜0.05）,细胞基因组DNA总体甲基化水平显著降低（P＜0.05）,SLE患者CD4+T细胞Gadd45a mRNA水平和SLEDAI评分呈显著正相关（R=0.568,P＜0.05）;与细胞基因组DNA总体甲基化水平呈显著负相关（R=-0.676,P＜0.01）。结论:SLE患者CD4+T细胞Gadd45a表达显著升高,且与DNA低甲基化及疾病活动性关联。第二部分紫外线对Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响第一节紫外线对Jurkat细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响目的:研究紫外线对Jurkat细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响。方法:分别以紫外线UVB 1.0J/cm2和1.5J/cm2照射Jurkat细胞后,于6小时、12小时、24小时和48小时收集细胞,采用Real-time RT-PCR法检测Gadd45a mRNA水平和甲基化敏感基因CD11a,CD70 mRNA水平,同时检测Jurkat细胞基因组DNA总体甲基化水平的变化。结果:（1）紫外线UVB1.0J/cm2照射后6小时,Jurkat细胞Gadd45amRNA水平显著升高（P＜0.01）,总体甲基化水平显著降低（P＜0.05）,CD11a,CD70 mRNA水平也升高,但差异无统计学意义（P＞0.05）。照射后12小时Jurkat细胞Gadd45a CD11a,CD70 mRNA水平均显著升高（P＜0.05）,Jurkat细胞总体甲基化水平显著降低（P＜0.05）。照射后24小时和48小时,Jurkat细胞Gadd45a mRNA水平升高,CD11a,CD70 mRNA水平升高,基因组DNA总体甲基化水平降低,但差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）紫外线UVB1.5J/cm2照射后6小时、12小时、24小时和48小时,Jurkat细胞Gadd45a,CD11a,CD70 mRNA水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,基因组总体甲基化水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结论:紫外线能诱导Jurkat细胞Gadd45a表达上调,同时甲基化敏感基因CD11a,CD70 mRNA表达升高,Jurkat细胞基因组DNA低甲基化。第二节紫外线对CD4+T细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响目的:研究紫外线对正常人CD4+T细胞Gadd45a表达和DNA甲基化水平的影响。方法:免疫磁珠法从3例正常人外周血中分离CD4+T细胞,紫外线UVB 1.5J/cm2照射正常人CD4+T细胞后,分别于6小时、24小时、48小时收集细胞,采用Real-time RT-PCR法检测Gadd45a mRNA,甲基化敏感基因CD11a,CD70 mRNA的表达,采用Western blotting法检测Gadd45a蛋白水平,同时检测CD4+T细胞基因组DNA总体甲基化水平的变化。结果:紫外线照射后6小时、24小时、48小时的CD4+T细胞Gadd45a,CD11a,CD70 mRNA水平均显著升高（P＜0.05）,且Gadd45a蛋白表达显著升高（P＜0.05）,基因组DNA总体甲基化水平降低,第48小时总体甲基化水平显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:紫外线能诱导CD4+T细胞Gadd45a表达上调,同时甲基化敏感基因CD11a,CD70 mRNA表达升高,细胞基因组DNA总体甲基化水平下调。第三部分Gadd45a表达异常与自身免疫关系的研究第一节Gadd45a过表达诱导自身免疫反应目的:诱导Gadd45a过表达对正常人CD4+T细胞甲基化敏感基因的表达、调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。方法:构建Gadd45a表达质粒PCDNA3.1-Gadd45a,电穿孔法瞬时转染正常人CD4+T细胞,采用Real-time RT-PCR法检测甲基化敏感基因CD11a,CD70 mRNA的表达,ELISA法检测细胞增殖活性、自身B细胞IgG抗体产量,试剂盒检测细胞基因组DNA总体甲基化水平及亚硫酸氢钠基因组测序法检测CD11a（ITGAL）序列特异性甲基化状态的改变。结果:转染PCDNA3.1-Gadd45a的CD4+T细胞Gadd45a,CD11a,CD70 mRNA水平升高,细胞增殖活性及自身B细胞的IgG抗体产量增加,总体甲基化水平降低,差异均有显著统计学意义（P＜0.05）。重亚硫酸氢钠测序结果显示ITGAL启动子调控序列平均甲基化水平显著降低（P＜0.01）,七个CG位点中有六个位点（-1263,-1255,-1191,-1159,-1121,-1111bp）发生了低甲基化。结论:Gadd45a过表达可诱导正常CD4+T细胞发生低甲基化,与自身免疫密切相关的甲基化敏感基因表达升高,细胞产生自身免疫性。第二节下调Gadd45a抑制自身免疫反应目的:抑制Gadd45a表达对SLE CD4+T细胞甲基化敏感基因的表达、调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。方法:设计针对Gadd45a的小干扰RNA,电穿孔法瞬时转染活动性SLE患者的CD4+T细胞,采用Real-time RT-PCR法检测Gadd45amRNA,甲基化敏感基因CD11a,CD70 mRNA的表达,流式细胞仪检测CD11a,CD70蛋白水平,ELISA法检测细胞增殖活性和IgG抗体产量。同时检测细胞基因组DNA总体甲基化水平及ITGAL特异性序列甲基化状态的改变。结果:转染后CD4+T细胞Gadd45a,CD11a,CD70 mRNA水平降低,CD11a染色细胞百分率减少,CD70平均荧光强度降低,细胞增殖活性及自身B细胞的IgG抗体产量下降（P＜0.05）。细胞基因组DNA总体甲基化水平升高,但差异无显著性。重亚硫酸氢钠测序结果显示CD11a（ITGAL）启动子特异性序列平均甲基化水平显著升高（P＜0.05）,七个CG位点中有四个位点（-1263,-1223,-1159,-1121）发生了高甲基化。结论:抑制Gadd45a的表达可逆转SLE患者CD4+T细胞的异常低甲基化,下调与自身免疫密切相关的甲基化敏感基因表达,抑制自身免疫反应。
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