华癸中生根瘤菌内源质粒间的相互作用及其对共生固氮的影响

论文摘要

从华中农业大学水稻田采集的紫云英根瘤中分离到62株华癸中生根瘤菌，经培养观察、显微观察和回接实验确认其中57株为典型的华癸中生根瘤菌。供试菌株的最早现瘤时间为8d，最迟超过30d，多数菌株为10-22d。对其中的44株质粒的检测结果表明：13株含3个质粒、21株含2个质粒、7株含1个质粒、3株不含质粒，大小范围为150-428kb。采用Tn5-mob-sacB转座子对含有的3个大质粒的HN3015菌株进行定向标记，获得各供试质粒的标记菌株。利用sacB基因对蔗糖的敏感性进行标记质粒消除实验，获得HN3015的质粒消除或缺失突变株，其中HN3015-1为第一大质粒pMhHN3015c消除突变株，HN3015-2为为第二大质粒pMhHN3015b消除突变株，HN3015-3为第三大质粒pMhHN3015a消除突变株，HN3015-6为pMhHN3015a部分缺失突变株。对HN3015与突变株的培养特征、生长速度和共生结瘤能力进行的研究结果表明：质粒消除或缺失突变株的培养特征均与出发菌株一致，第一大质粒pMhHN3015c与固氮有关，第二大质粒pMhHN3015b的消除则失去结瘤能力，第三大质粒pMhHN3015a的消除或缺失不但未影响结瘤与固氮能力，其消除反而可增强突变株HN3015-3的竞争结瘤能力和共生效率。抗酸性实验结果表明3个内源质粒均对HN3015的抗酸性有正控制作用，并对其抗碱性起负控制作用。生长实验结果表明：3个内源质粒亦对生长速率有负控制作用。将pMhHN3015c：：Tn5-mob-sacB从供体菌HN3015T18导入受体菌HN308SR后，受体菌的第一大质粒pMhHN308c被消除，表明pMhHN3015c与pMhHN308c不相容，应归于同一不相容群。在对转移接合子HN308SRN18进行质粒消除时，发现其内源小质粒pMhHN308a与pMhHN3015c：：Tn5-mob-sacB同时消除，获得了仅含pMhHN308b的质粒消除突变株HN308SRN18D。盆栽结瘤试验结果表明：转移接合子HN308SRN18只能在紫云英上形成无效根瘤，证明其内源大质粒pMhHN308c与固氮有关，且不能为导入大质粒pMhHN3015c取代。质粒消除突变株HN308SRN18D依然保持结瘤能力的结果表明pMhHN308b与结瘤有关。将HN3015的另一标记小质粒pMhHN3015a：：Tn5-mob-sacB导入HN308SR时，发现受体菌的第二大质粒被消除，显然pMhHN3015a与pMhHN308b不相容，应属于同一不相容群，并与HN308SR的pMhHN308a和pMhHN308c属于不同的不相容群。但转移接合子HN308SRN29的质粒消除实验未获得质粒消除突变株。pMhHN3015a和pMhHN308a的大小相近，仅凭凝胶电泳位置难于区分。盆栽结瘤试验结果表明：pMhHN308a与HN308的结瘤有关，而含有质粒pMhHN3015a、pMhHN308a和pMhHN308c的转移接合子HN308SRN29却失去了结瘤能力。本结果表明：pMhHN308a可能因与pMhHN3015a发生了重组而丢失了结瘤基因，其Tn5亦可能因转座至染色体而不能获得质粒消除突变株。用三亲本杂交法将供体菌HN3015的2个标记质粒pMhHN3015a和pMhHN3015c分别导入受体菌7653R-1SR时，发现这2个质粒均可分别与7653R-1SR中的pMh7653Ra共存，它们应属于不同的不相容群。但转移接合子7653R-1SRN29的质粒消除突变株7653R-1SRN29D-B在消除外源质粒的同时却产生了一个新质粒p76H4。但在另一质粒消除突变株7653R-1SRN29D-A中却未发现这个新质粒。盆栽结瘤试验结果表明：7653R-1SRN18只能形成少数无效根瘤，其瘤数与7653R-1SR相近。前面已证实pMhHN3015c与固氮能力有关，但它的导入却未能恢复受体菌7653R-1SR的固氮能力。7653R-1SRN18的质粒消除突变株依然与7653R-1SR-样，只能形成少量无效根瘤。7653R-1SRN29在紫云英根上亦形成无效根瘤，但瘤数接近7653R。前面已证实pMhHN3015a能抑制HN3015的共生效应，但本研究将它导入7653R-1SR时却反而提高了转移接合子的结瘤能力。7653R-1SRN29的质粒消除突变株7653R-1SRN29D-A也只能形成少量无效根瘤，但另一质粒消除突变株7653R-1SRN29D-B却完全丧失了结瘤能力。将7653R的共生质粒pMh7653Rb导入受体菌HN308SR时，发现受体菌的两个稳定内源质粒pMhHN308b和pMhHN308c随着外源质粒pMh7653Rb的导入而同时被消除。盆栽结瘤试验结果表明：pMhHN308b与结瘤相关，由于pMh7653Rb的导入能维持HN308SRN14的结瘤能力，其瘤数也超过HN308SR，但不能替代pMhHN308b和pMhHN308c。质粒消除突变株HN308SRN14D只形成少量无效根瘤，确认pMhHN308a与HN308的结瘤能力有关。用三亲杂交法将7653R的共生质粒pMh7653Rb导入HN3015SR时发现所获转移接合子HN3015SRN14的第二大质粒为pMhHN7653Rb，受体菌HN3015SR的第二大质粒则由于外源质粒的不相容性而被消除。HN3015SRN14的质粒消除实验获得了消除第二大质粒的HN3015质粒消除突变株（仅含pMhHN3015a和pMhHN3015c）。盆栽结瘤试验结果表明：转移接合子HN3015SRN14只能形成无效根瘤，其标记质粒消除突变株HN3015SRN14D则完全失去结瘤能力。采用通用引物RC1和RC3对6个供试转移接合子及其质粒消除突变株进行repC基因的PCR扩增结果表明：除质粒消除突变株7653R-1SRN18D和7653R-1SRN29D未能扩出repC基因外，其它供试菌株均扩出了750bp左右的repC序列。对所有供试10个菌株的repC序列测定与同源性比较结果表明：供试华癸中生根瘤菌株的repC序列高度相似（99％），但与其它根瘤菌的repC基因有明显差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 根瘤菌内源质粒的研究进展
• 1.1.1 共生质粒的功能
• 1.1.2 非共生质粒的功能
• 1.1.3 根瘤菌质粒的多样性
• 1.1.4 根瘤菌质粒的转移性、稳定性和复制
• 1.1.5 根瘤菌质粒相互作用
• 1.1.6 根瘤菌质粒的消除方法
• 1.2 华癸中生根瘤菌的研究进展
• 1.2.1 华癸中生根瘤菌的遗传多样性
• 1.2.2 华癸中生根瘤菌的质粒多样性
• 1.2.3 华癸中生根瘤菌质粒的功能
• 1.2.4 华癸中生根瘤菌的结瘤因子
• 1.2.5 华癸中生根瘤菌的结瘤基因
• 1.2.6 华癸中生根瘤菌的胞外多糖
• 1.2.7 华癸中生根瘤菌的生理生化
• 1.2.8 插入顺序、nifA、opa22基因鉴定和外源基因表达
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试的菌株和质粒
• 2.1.2 供试植株品种及来源
• 2.1.3 培养基与培养条件
• 2.1.4 抗生素与使用浓度
• 2.1.5 缓冲液与试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 根瘤中根瘤菌的分离
• 2.2.2 根瘤中类菌体的观察
• 2.2.3 活菌数测定
• 2.2.4 菌株的纯化
• 2.2.5 植物回接实验
• 2.2.6 根瘤菌质粒的快速检测
• 2.2.7 根瘤菌抗药性自发突变株的筛选
• 2.2.8 带有Tn5-mob-sacB的根瘤菌转座突变株的筛选
• 2.2.9 质粒上带有Tn5-mob-sacB标记菌株的筛选与标记质粒的消除
• 2.2.10 根瘤菌种内内源质粒的诱动转移与转移接合子的质粒消除
• 2.2.11 根瘤菌质粒稳定性的检测
• 2.2.12 根瘤菌生长速度的测定
• 2.2.13 根瘤菌抗酸（碱）性的测定
• 2.2.14 植物盆栽结瘤实验
• 2.2.15 竞争结瘤实验
• 2.2.16 根瘤固氮酶活测定
• 2.2.17 根瘤石蜡切片
• 2.2.18 分子生物学基本操作
• 2.2.19 细菌总DNA提取
• 2.2.20 统计方法
• 2.2.21 生物信息学
• 3 结果与讨论
• 3.1 华癸中生根瘤菌的分离、回接与质粒检测
• 3.1.1 华癸中生根瘤菌的分离
• 3.1.2 植物回接实验
• 3.1.3 根瘤菌质粒的快速检测
• 3.1.4 小结与讨论
• 3.2 华癸中生根瘤菌HN3015的质粒消除及其生物学特征
• 3.2.1 HN3015质粒的消除
• 3.2.2 HN3015质粒的生物学特征
• 3.2.3 小结与讨论
• 3.3 标记菌株的筛选与结瘤功能的鉴定
• 3.3.1 抗药性突变株的筛选
• 3.3.2 带有Tn5-mob-sacB的根瘤菌转座突变株的筛选
• 3.3.3 小结与讨论
• 3.4 内源质粒不相容性的测定
• 3.4.1 HN3015和HN305内源质粒不相容性的测定
• 3.4.2 HN3015和7653R-1内源质粒不相容性的测定
• 3.4.3 7653R和HN308、HN3015内源质粒不相容性的测定
• 3.4.4 7653RT14的pMh7653Rb向HN3015-2SR和HN3015-3SR转移
• 3.4.5 内源质粒在不同菌株组合间诱动转移频率的测定
• 3.4.6 转移接合子的质粒稳定性测定
• 3.4.7 小结与讨论
• 3.5 Kan基因和repC基因的鉴定
• 3.5.1 Kan基因的鉴定
• 3.5.2 质粒复制基因repC的鉴定
• 3.5.3 小结与讨论
• 4 总结与展望
• 4.1 已取得的主要研究成果
• 4.2 进一步研究的设想
• 5 参考文献
• 致谢
• 附录