啤酒酵母在不同碳源条件下中间代谢途径关键酶活性分析

论文摘要

酵母是自然界中分布最广泛、也是最安全的模式微生物，已经在传统发酵工业和现代生物技术中发挥了重要的作用。本文以对酵母生长代谢有较大影响的碳源物质为研究对象，通过对优化设计的人工配制培养基，深入研究了不同碳源对酵母生长代谢相关性的影响，以及酵母细胞凋亡过程中酵母代谢调节的变化过程。实验从酵母细胞代谢关键酶的活性入手，对耐高渗酵母与普通酿酒酵母在丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活性特征方面的差异进行了比较分析，建立了一套稳定的酶活力测定方法。发现耐高渗酵母在高渗环境的诱导下，其EMP途径、磷酸戊糖途径的关键酶活力都高于普通酿酒酵母。耐高渗酵母具有高活力的乙醇脱氢酶使其能高效的将丙酮酸转化成乙醇。并且三羧酸循环中的关键酶异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性也得到加强。从而维持了耐高渗酵母在高渗、高酒精环境下生长需要与能量代谢的平衡。酒精的积累一直被认为是影响酵母发酵活力的主要因素，实验发现有机酸类物质在发酵过程中也会在培养基中积累，而乙酸是多种有机酸中积累量较大的一种，并且酵母在缺乏糖类物质作为碳源的情况下，能利用乙酸盐作为碳源物质进行生长。研究结果表明，与葡萄糖对照组相比，乙酸盐培养条件下啤酒酵母细胞中的丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性受到了抑制，异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性得到一定程度的增强，异柠檬酸裂解酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的活性有显著增强。乙酸盐对酵母的各个主要代谢途径都产生影响。在分析酵母胞内酶活性代谢调控的过程中发现细胞内各主要代谢途径的酶在酵母细胞凋亡过程中受到的影响。结果显示：细胞呼吸作用衰减与细胞凋亡进程密切相关，细胞中异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的衰减速率明显高于丙酮酸激酶和乙醇脱氢酶。酿酒酵母细胞凋亡是从线粒体损伤和呼吸链相关酶失活开始的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 酵母
• 1.1.1 酵母概述
• 1.1.2 啤酒酵母细胞结构
• 1.1.3 酵母细胞生长过程
• 1.2 酵母的营养与生长
• 1.2.1 营养元素的生理功能
• 1.2.1.1 组成细胞的生物大分子
• 1.2.1.2 碳元素
• 1.2.1.3 氮元素
• 1.2.1.4 无机元素
• 1.3 代谢工程
• 1.3.1 代谢工程的发展
• 1.3.2 代谢工程分析方法分类
• 1.3.2.1 代谢控制分析（MCA）
• 1.3.2.2 代谢通量分析（MFA）
• 1.3.2.3 生化系统理论（BST）
• 1.3.3 酵母代谢途径
• 1.4 酵母发酵过程中的基本调控
• 1.4.1 酵母细胞中代谢调节的部位
• 1.4.2 酵母代谢途径的调节模式
• 1.4.2.1 影响酶活性的调节模式
• 1.4.2.2 影响酶分子数的调节模式
• 1.4.2.3 通过酶实现的代谢调节的机制
• 第二章 渗透压对酿酒酵母胞内代谢关键酶活性的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 发酵试验
• 2.1.4 细胞干重的测定
• 2.1.5 葡萄糖浓度的测定
• 2.1.6 乙醇含量的测定
• 2.1.7 细胞的收获
• 2.1.8 酶蛋白提取
• 2.1.9 酶蛋白定量
• 2.1.10 酶活性检测
• 2.1.11 酶比活力计算
• 2.2 结果和分析
• 2.2.1 不同发酵环境下酵母生长曲线的变化
• 2.2.2 糖酵解和磷酸戊糖途径中关键酶活性变化
• 2.2.3 三羧酸循环中关键酶活性变化
• 2.2.4 乙醇脱氢酶活性的变化
• 2.3 讨论
• 第三章 乙酸盐培养条件下酵母代谢及胞内关键酶活性变化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 发酵试验
• 3.1.4 细胞生长曲线的绘制
• 3.1.5 细胞的收获
• 3.1.6 酶蛋白提取
• 3.1.7 酶蛋白定量
• 3.1.8 酶活性检测
• 3.1.9 酶比活力计算
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 酵母在葡萄糖和乙酸盐不同碳源上细胞生长曲线的绘制
• 3.2.2 细胞形态观察
• 3.2.3 酿酒酵母中代谢途径关键酶活性测定
• 3.3 讨论
• 第四章 酵母细胞凋亡过程中的生理代谢机制
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 发酵试验
• 4.1.4 细胞的收获
• 4.1.5 酶蛋白提取
• 4.1.6 酶蛋白定量
• 4.1.7 酶活性检测
• 4.1.8 酶比活力计算
• 4.2 结果和分析
• 4.2.1 显微观察
• 4.2.2 酵母中代谢途径关键酶活性动态变化
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 硕士期间参与项目及科研成果
• 致谢