鱼类神经坏死病毒的分离和部分特性研究

论文摘要

鱼类病毒性神经坏死病（Viral nervous necrosis,简称VNN）又称病毒性脑病和视网膜病（Viral encephalopathy and retinopathy,VER）,是由鱼类病毒性神经坏死病毒（Viral nervous necrosis virus,简称VNNV,属于乙型野田村病毒属）引起的一种新的传染性疾病。是世界范围的一种鱼类流行性传染病,该病最早于1985年报道于日本,现已遍及非洲外的所有地方。该病临床上主要以鱼苗出现神经异常为特征,表现为不正常游泳:螺旋状游动、在水中打转、腹部向上浮于水面;组织病理以患病鱼中枢神经系统和视网膜中间层出现空泡为特征。中国台湾和广州分别从1997年和2001年开始报道此病,目前已对我国水产养殖业造成严重危害。国内关于VNNV的报道集中在病理切片和核酸序列分析上,而关于此病毒在条纹月醴细胞系（striped snakehead,SSN1）分离培养及理化特性方面的报道较少。从福建厦门收集发病青斑病料经处理接种SSN1细胞,设定不同温度增值病毒。通过制备病理切片、观察细胞病变（cytopathic effects,CPE）、PCR扩增VNNV部分核酸片段和电镜观察来确定分离物是否为VNNV。结果通过病理切片可以在病鱼视网膜中看到大量空泡化现象,接种的SSNl细胞在25℃培养2—3天表现出CPE,PCR检测结果为VNNV核酸阳性,电镜观察细胞切片显示有大量病毒粒子排列在感染的SSN1细胞质中,负染可以看到其为直径25—30nm的二十面体,无囊膜。综上表明所分离的为VNNV。随后对其一些特性进行研究。该病毒在SSN1细胞中25℃时滴度可以达到105.1/0.1mL,石斑鱼吻端细胞系（grouper proboscis,GP）、鲤鱼上皮瘤细胞系（epithelima popuasum cuprini,EPC）、肥头鲤细胞系（pimephales promelas,FHM）在28℃、25℃、20℃时对该病毒都没有CPE,且PCR检测VNNV核酸为阴性。病毒经55℃30min、pH=3和pH=11各1h处理后下降2个滴度,经氯仿处理后滴度不变。以上说明GP、EPC、FHM这些细胞对该病毒都不敏感;该病毒对热（55℃30min）和酸碱（pH=3和pH=11）都比较敏感;对氯仿不敏感说明病毒没有囊膜,符合VNNV的形态特征。此研究从VNNV培养温度及SSN1细胞培养环境等方面为制定细胞分离培养VNNV规程提供了一定的数据依据,具有一定的诊断意义。另外这是在我国首次借助SSN1细胞报道了VNNV的理化特性,为养殖场环境控制提供了一定的理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 1 文献综述及研究的目的与意义
• 1.1 鱼类病毒性神经坏死症
• 1.1.1 鱼类病毒性神经坏死症的历史及危害
• 1.1.2 流行病学
• 1.1.3 临床症状
• 1.1.4 病理变化和致病机制
• 1.1.5 病毒分类及基本特征
• 1.1.5.1 抗原性
• 1.1.5.2 病毒生物合成过程
• 1.1.6 诊断方法
• 1.1.6.1 显微镜观察
• 1.1.6.2 免疫学方法
• 1.1.6.3 分子生物学方法
• 1.1.6.4 细胞培养法
• 1.1.7 防治
• 1.2 VNNV的细胞培养和理化特性
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.1.1 SSN1
• 1.2.1.2 E11
• 1.2.1.3 GF-1等
• 1.2.2 VNNV的理化特性
• 1.3 本研究的目的与意义
• 2 鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 血清
• 2.1.3 主要药品与试剂
• 2.1.4 主要培养基
• 2.1.5 细胞消化液
• 2.1.6 双抗（100×）
• 2.1.7 分子生物学试剂
• 2.1.8 石蜡切片试剂
• 2.1.9 正染细胞切片试剂
• 2.1.10 病料采集与处理
• 2.1.11 组织病理观察
• 2.1.12 细胞的培养
• 2.1.13 病毒分离
• 2.1.13.1 病料处理接种
• 2.1.13.2 收集细胞悬液
• 2.1.14 病毒核酸鉴定
• 2.1.14.1 病毒核酸抽提
• 2.1.14.2 RT-PCR
• 2.1.14.3 PCR产物检测
• 2.1.15 病毒的生物学特性
• 50)测定'>2.1.15.1 病毒滴度(TCID₅₀)测定
• 2.1.15.2 细胞对VNNV的敏感性
• 2.1.16 病毒理化特性
• 2.1.16.1 热稳定性试验
• 2.1.16.2 pH敏感性试验
• 2.1.16.3 氯仿敏感试验
• 2.1.17 超微观察
• 2.1.17.1 负染样品制备和电镜观察
• 2.1.17.2 超薄切片制备和电镜观察
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 病鱼临床症状
• 2.2.2 组织病理观察
• 2.2.3 病毒分离
• 2.2.4 RT-PCR
• 2.2.5 病毒的生物学特性
• 50'>2.2.5.1 VNNV在细胞中的增殖滴度TCID₅₀
• 2.2.5.2 细胞对VNNV的敏感性
• 2.2.6 病毒理化特性
• 2.2.6.1 热稳定性试验
• 2.2.6.2 pH敏感性试验
• 2.2.6.3 氯仿敏感性试验
• 2.2.7 超微观察
• 2.2.7.1 负染
• 2.2.7.2 正染细胞切片
• 2.3 讨论
• 2.3.1 临床症状
• 2.3.2 VNNV的分离和纯化
• 2.3.3 VNNV的细胞敏感性试验
• 2.3.4 VNNV的最适增值温度
• 2.3.5 VNNV的理化特性
• 2.3.6 SSN1的细胞培养
• 2.3.7 VNNV的超微形态观察
• 2.3.8 诊断
• 参考文献
• 附录
• 致谢