论文摘要
猪2型圆环病毒（Porcine circovirus type 2, PCV2）可单独感染,也可继发感染,近几年在世界各地普遍流行,是对养猪业危害很大的一类疾病。它可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合病（PDNS）、繁殖障碍、猪呼吸综合征（PRDC）、仔猪先天性震颤、增生性/坏死性肠炎（PNP）、“无名高热症”等。在临床上PCV2普遍存在免疫抑制和免疫激活现象,降低猪的免疫力,使猪生长缓慢,造成其他疾病的大爆发。目前对于此病没有有效的治疗方法,需用疫苗进行预防。目前,西欧与美国已有商品化疫苗注册上市,主要是灭活疫苗和亚单位疫苗,国内也有灭活疫苗上市。但是由于PCV2在细胞上增殖滴度低、体外培养比较困难、灭活疫苗成本高、注射次数多且易造成机体应激,因此,研究廉价、安全、有效的新型疫苗是目前研究的重点。本研究探索了新型PCV2疫苗,构建了基于杆状病毒载体的重组毒疫苗与ORF2亚单位疫苗,并通过小鼠实验进一步研究这两种疫苗的免疫原性。具体工作如下：1、杆状病毒介导的ORF2重组毒疫苗的构建及免疫原性研究：基因合成pcDNA3.1-iel基因,酶切PFastBac-VSV/G-SV40载体（BamHI）和pcDNA3.1-ie 1 （BglII,BamHI）并连接,载体上的CMV启动子被ie1启动子替代。在iel启动子的多克隆位点下插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,获得重组的杆状病毒AC-V-EGFP。同样,在iel启动子的多克隆位点下插入PCV2 ORF2的整个读码框,构建重组的杆状病毒AC-V-ORF2。将这两种重组杆状病毒体外分别转导哺乳动物细胞和转染Sf9细胞,均检测到目的基因的高效表达。将重组杆状病毒以109pfu/mL100ul的剂量肌肉注射小鼠,首免后三周可检测到ELISA抗体和中和抗体,加强免疫后三周Ac-V-ORF2的ELISA平均抗体滴度达到1：1152,中和抗体滴度达到1：6。因此,Ac-V-ORF2免疫组表现出较好的免疫效果,可以作为PCV2的一种新型的候选疫田。2、杆状病毒介导的ORF2亚单位疫苗的构建及免疫原性研究人工合成PCV2 ORF2基因,构建转移载体pFastBacDual-2ORF2。将此载体转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选后获得穿梭质粒Bacmid-2ORF2。将此质粒转染Sf9细胞,获得杆状病毒Ac-2ORF2。将此杆状病毒转染Sf9昆虫细胞后,ORF2基因可在细胞中大量表达。将表达的ORF2蛋白制备成业单位疫苗,分三个剂量：106个cell/mL、5×106个cell/mL和107个cell/mL免疫4～6周龄的BALB/c小鼠。试验结果表明：首免三周后,三个免疫组106个cell/mL、5×106个cell/mL和107个cell/mL小鼠体内已有ORF2 ELISA抗体和中和抗体产生,加强免疫后此三组的抗体水平继续升高,其中5×106个cell/mL最高,ELISA抗体滴度可达到1：2133,中和抗体滴度可达到1：8.33。表明此杆状病毒表达的ORF2蛋白有较好的免疫原性,可以作为PCV2的一种新型的候选业单位疫苗。