论文摘要
目的:本研究通过观察血管紧张素受体阻断剂（angiotensin type 1 receptorblockers,ARB）替米沙坦、厄贝沙坦对过氧化酶体增殖物激活受体γ（peroxisomeproliferator activated receptor gamma,PPARγ）及过氧化酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα）的作用以探讨其改善糖脂代谢的机制。方法:（1）将构建的PPARγ或PPARα编码蛋白质DNA片断的全长表达质粒、过氧物酶体增生因子反应元件（peroxisome proliferators response elements,PPREs）调控的荧光素酶的表达质粒与pRL表达载体及内质控pRL-TK应用脂质体（SuperFect）瞬时转染COS-7细胞,24小时后分别加入不同剂量的吡格列酮（PGZ）或非诺贝特及缬沙坦、氯沙坦、替米沙坦、厄贝沙坦、PPARγ特异性阻断剂GW9662,继续孵育12、24、36、48、60小时,应用双荧光素酶基因报告检测系统检测荧光素酶活性以反映PPARγ或PPARα表达活性。（2）将构建的PPRE调控的荧光素酶的表达质粒与pRL表达载体应用脂质体（SuperFect）稳定转染后的3T3-L1前脂肪细胞,经诱导分化成为成熟的脂肪细胞,24小时后加入不同浓度的吡格列酮及替米沙坦、厄贝沙坦、PPARγ特异性阻断剂GW9662,继续孵育6、12、18、24、30小时,应用双荧光素酶基因报告检测系统检测荧光素酶活性以反映PPARs表达活性。（3）在分化的3T3-L1脂肪细胞中,分别加入不同浓度的替米沙坦、厄贝沙坦,刺激24小时后,应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测PPARγmRNA、PPARαmRNA的表达,用Western blot杂交方法检测PPARα蛋白质的表达。结果:（1）在转染后的COS-7细胞中,PGZ呈剂量及时间依存性地增加PPARγ荧光素酶活性,PGZ 10-5mol/L达到最高值,为对照组的7.7倍（16.85±4.28vs 2.10±0.18,P＜0.01）。缬沙坦、氯沙坦不能增加PPARγ荧光素酶活性;替米沙坦和厄贝沙坦均呈剂量和作用时间依赖性地增加PPARγ荧光素酶活性,两者在10-4mol/L浓度作用48 h时分别刺激PPRE调控的荧光素酶活性较对照组增高11倍（47.78±11.76 vs 4.33±0.45,P＜0.01）和9.9倍（43.27±13.02 vs 4.33±0.45,P＜0.01）,这种刺激作用在48h达到高峰。（2）在转染后的COS-7细胞中,非诺贝特呈剂量及时间依存性地增加PPARα荧光素酶活性,非诺贝特10-4mol/L达到最高值,为对照组的4.1倍（40.50±5.61 vs 9.88±1.67,P＜0.01）。缬沙坦、氯沙坦不能增加PPARα荧光素酶活性;替米沙坦和厄贝沙坦均呈剂量和作用时间依赖性地增加PPARα荧光素酶活性,两者在10-4mol/L浓度作用60 h时分别刺激PPRE调控的荧光素酶活性较对照组增高3.8倍（37.66±4.45 vs 9.88±1.67,P＜0.01）和2.6倍（25.72±3.71vs 9.88±1.67,P＜0.01）,这种刺激作用在60h达到高峰。（3）COS-7细胞中,厄贝沙坦及替米沙坦激活PPARγ的作用均可被GW9662抑制,替米沙坦及厄贝沙坦激活PPARα的作用不能被PPARγ特异性抑制剂GW9662抑制。在诱导分化的3T3-L1脂肪细胞,厄贝沙坦及替米沙坦激活PPARs的作用可被GW9662部分抑制。（4）替米沙坦、厄贝沙坦均呈剂量依赖性地增强分化的3T3-L1脂肪细胞PPARγmRNA、PPARαmRNA及蛋白的表达。结论:（1）成功地进行了PPARγ、PPARα、PPRE质粒的扩增与提取,构建具有较高敏感性的PPARs表达筛选系统。（2）利用该筛选系统明确替米沙坦和厄贝沙坦具有增加PPARγ及PPARα转录活性的作用,且激活PPARα的作用是独立于激活PPARγ之外。说明替米沙坦、厄贝沙坦可能通过同时激活PPARγ、PPARα来改善T2DM患者糖脂代谢。
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