论文摘要
原发性肝癌在世界范围内属于常见肿瘤,主要发生于亚洲和撒哈拉以南非洲地区,其中约半数发生于中国。肝癌预后很差,即使根治术后5年生存率仅17%-53%,而且复发率很高。每年新发病例数与同年死亡病例数接近。造成肝癌预后差的原因主要有两个:其一是肝癌对常规的化疗几乎无效;其二是现有的肝癌早期诊断指标存在不足,超过80%的患者就诊时处于进展期或失去手术切除机会。肝癌是多基因参与、多步骤发生的过程。但是目前对肝癌发生、发展中参与基因的了解还很有限,研究肝癌发生、发展的相关基因对阐明肝癌发生的分子机制具有非常重要的意义,对肝癌发生相关基因的深入了解能够为寻找潜在的早期诊断和预后标记及筛选治疗靶点提供有用的信息和依据。在本课题中,我们使用抑制性差减杂交结合芯片方法鉴定人肝细胞肝癌相关基因,鉴于对人体肝癌研究只能针对某一阶段,而对动物肝癌模型的研究可以系统分析肝癌发生、发展过程中的全基因组表达谱改变,因此,我们使用二乙基亚硝胺诱导方法建立了大鼠肝癌模型,结合Affymetrix基因芯片技术得到了模型大鼠从肝硬化至肝转移阶段的差异表达基因谱。在上述工作基础上,本研究从中选取了一条在四个阶段都高表达的基因（Fn14）进行了在肝癌细胞中的功能初步探讨,得到了一些有意义的结果。第一部分抑制性差减杂交结合cDNA芯片方法筛选人肝细胞肝癌相关基因原发性肝细胞肝癌（HCC）的分子遗传学背景目前并不完全清楚。在本课题中,我们使用抑制性差减杂交方法（SSH）结合cDNA芯片分析技术分离和鉴定肝细胞肝癌中的差异基因表达谱,鉴定肝癌组织与癌旁非肿瘤组织差异表达已知基因45条,其中26条为肝癌组织表达上调基因,19条为肝癌组织表达下调基因。这些已知基因表达产物呈现广泛的生物学功能,参与众多生物学过程,诸如蛋白质的转录和生物合成、脂质和蛋白质的代谢、细胞增殖、信号传导等。此外,还发现参与丙酮醛解毒的谷胱甘肽结合蛋白GLO1表达增高以及上调前列腺素E（2）合成的酶PLA2G10在肝癌组织中表达上调。在肝癌组织中发现的下调基因中大多数合成肝脏特异性蛋白（纤维蛋白原、补体、淀粉样蛋白、白蛋白、触珠蛋白、血红素蛋白和α-酸性粘蛋白）。参与生物转化的细胞色素家族成员在肝癌组织中表达下调。一些基因编码产物是酶如醇脱氢酶（ADH1C）、醛脱氢酶（ALDH6A1）、醛缩酶（ALDOB）、精氨酸酶（Arginase）和酯酶（CES1）。同时,我们也分离到锌转运体（Zip14）和功能未知基因ZBTB11（zinc fingerand BTB domain containing 11）在肝癌组织中表达下调。在肝癌组织中有7条未知EST与数据库中序列没有同源性。通过应用SSH结合cDNA芯片技术我们分离鉴定了一些肝癌相关基因,其中一些既往没有相关报道。对这些基因的深入研究为了解肝癌发生发展分子机制提供有用的信息。第二部分大鼠肝癌模型发生过程中全基因表达谱的分析为了系统分析肝癌发生、发展过程中全基因表达谱改变,了解其中起重要作用的基因,应用DEN诱导方法建立了大鼠肝癌模型,大鼠模型肝脏病变经过肝脏非特异性损伤、肝脏纤维化和硬化、异型增生结节和肝癌形成和转移阶段。选取正常大鼠肝组织、肝硬化组织（诱癌第12周）、异型增生结节（第14周）、肝癌结节（第16周）以及肺转移大鼠的肝癌组织（第20周）进行Affymetrix基因芯片检测。差异基因表达谱结果显示,肝硬化组织（12周）上调基因681个,下调基因687个;异型增生结节（14周）上调基因857个,下调基因732个;肝癌结节（16周）上调基因1223个,下调基因1016个;肝癌转移阶段（20周）上调基因999个,下调基因906个。四个阶段共同上调基因349个,其中已知基因246个;共同下调基因345个,其中已知基因215个,剩余为推测基因、转录位点和完全未知基因。我们选取部分差异表达基因通过实时荧光定量RT-PCR技术证实了基因芯片结果的可靠性。差异表达基因参与众多的生物学过程和分子功能,包括物质代谢、物质转运、细胞增殖、细胞凋亡、细胞粘附、血管生成等。一些差异表达基因与炎症反应、免疫反应和应激反应相关。因此认为,在肝炎、纤维化和硬化及其相应细胞外基质改变的结构基础上,炎症反应、免疫反应和应激反应为肝癌发生、发展提供了多种细胞因子组成的微环境,众多相关基因改变造成细胞增殖和凋亡之间的不平衡,同时新生血管形成旺盛,因而肝癌发生并逐渐演进。通过系统分析模型大鼠肝癌发生过程中的基因表达谱改变,发现了肝癌发生、发展过程中可能起重要作用的差异表达基因,而且许多基因和肝癌的相关性是既往没有报道的,这些差异基因的发现为寻找肝癌诊断和预后的候选分子和筛选治疗靶点提供了有用的信息和基础。第三部分Fn14在肝癌细胞中功能的初步探讨Fn14基因是在模型组大鼠肝硬化组织（12周）、异型增生结节（14周）、早期肝癌结节和肺转移大鼠肝癌结节（20周）中均高表达的基因之一。本实验探讨Fn14对肝癌细胞凋亡和存活的影响及分子机制。建立Fn14过表达细胞模型,细胞核荧光染色和流式细胞仪检测细胞凋亡,MTT方法分析细胞存活率。结果发现Fn14高表达提高肝癌细胞存活率:TRAIL处理pcDNA3.1-Fn14转染细胞存活抑制率11.82%vs TRAIL处理pcDNA3.1转染细胞存活抑制率29.69%（p＜0.05）,抵抗TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡:TRAIL处理后pcDNA3.1转染细胞凋亡率24.17%vs TRAIL处理后pcDNA3.1-Fn14转染细胞凋亡率8.55%。进一步机制探讨发现,Fn14高表达促进肝癌细胞存活和抵抗TRAIL诱导凋亡是部分依赖于NF-κB活性的:NF-κB活性抑制剂预处理pcDNA3.1-Fn14转染细胞后再经TRAIL诱导细胞存活抑制率29.64%vs不经NF-κB活性抑制剂预处理的pcDNA3.1-Fn14转染细胞直接TRAIL诱导细胞存活抑制率11.82%（p＜0.05）;NF-κB活性抑制剂预处理pcDNA3.1-Fn14转染细胞再经TRAIL诱导后细胞凋亡率19.65%vs不经NF-κB活性抑制剂预处理pcDNA3.1-Fn14转染细胞直接TRAIL诱导细胞凋亡率9.82%。因此认为Fn14提高肝癌细胞存活和抵抗细胞毒性剂诱导凋亡,这些功能部分依赖于NF-κB活性。