论文摘要
安徽砀山酥梨自然保护区梨种质资源丰富,砀山县号称“中国梨都”。砀山酥梨在世界水果市场占据重要地位。由于梨种内变化大,加上种间的杂交,使砀山酥梨自然保护区梨在长期的进化和栽培中形成了丰富的资源类型。本试验对砀山酥梨自然保护区梨S基因进行研究,对探讨梨自交不亲和的分子机理、有效利用这些资源、加快梨育种进程有重要意义。特异引物PCR方法是一种高效、稳定、可靠的基因克隆手段。本试验按照S基因两端保守序列,合成PCR克隆特异引物P1、P2。通过对影响特异引物PCR体系的各主要因素的研究,建立了砀山酥梨自然保护区梨S基因分析的反应体系:在50μL反应总体积中,10×Buffer 5μL,Mgcl2 0.10μm,dNTPs 0.02μm,P1 0.02μm,P2 0.02μm,ExTaqDNA 1.0U,模板DNA 30 ng,加超纯水至50μl。最佳的反应参数是:94℃预变性3 min之后,94℃变性15sec、退火52℃30 sec、延伸72℃2 min、30个循环,72℃延伸7min。利用确立的特异引物PCR技术体系对砀山酥梨自然保护区的27个梨品种的S基因进行克隆与分离。在新高、雪花梨、丰水、南果梨、鸡爪黄、鹅黄、杜梨、香面梨、伏酥、红巴梨、锈酥、细皮酥、良梨早酥、马蹄黄等14个品种中,各克隆出一条S基因条带;而在库尔勒香梨、莱阳慈梨和紫酥梨等3个品种则各克隆出了两条S基因条带。克隆出的S基因条带长度均在300bp～500bp。另外,红香酥、黄冠、早美酥、扁酥、八怪梨、油皮酥、王酥、砀山酥梨、桂酥、鸭梨等10个梨品种没有克隆出S基因条带。试验以一次克隆产物为模板进行二次克隆并回收、纯化、克隆、测序。应用BLAST在线软件（www.ncbi.nlm.gov/blast/）进行碱基序列比对分析,确定20条S基因的碱基序列中有14个不同的S基因类型,应用ClustalW软件进行在线聚类（www.ebi.ac.uk./ClustalW）,分析不同的S基因类型差异,鉴定出14个品种的一个S等位基因和3个品种的S基因型。在试验过程中,对S基因回收纯化、连接转化、PCR检测等试验方法进行了改进。为提高梨S基因研究的效率提供新的依据。
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摘要ABSTRACT1 文献综述1.1 梨自交不亲和性（SI）的表现1.1.1 梨自花授粉结实率品种间的差异。1.1.2 梨配子体型自交不亲和性（SI）的形态学表现。1.2 梨自交不亲和遗传机理1.2.1 梨自交不亲和与S基因1.2.2 梨花柱S糖蛋白的作用机理1.3 梨自交不亲和S基因表达特性1.3.1 S基因表达的品种间差异1.3.2 不同S基因表达能力的差异1.3.3 不同发育阶段的花柱内S基因表达差异1.3.4 自交不亲和S基因的变异1.4 关于S基因型确定与S基因克隆方法1.4.1 S基因型确定研究方法2 引言2.1 砀山酥梨自然保护区梨种质资源的概述2.2 砀山酥梨自然保护区梨S基因型研究的目的和意义2.3 国内外研究现状综述2.3.1 国外对梨自交不亲和的研究进展2.3.2 中国对梨S基因型的研究进展2.4 技术路线和研究内容2.4.1 具体技术路线:2.4.2 研究内容3 材料与方法3.1 材料3.2 仪器与试剂3.2.1 仪器与设备3.2.2 试剂及配制3.3 方法3.3.1 基因组DNA的提取方法3.3.2 梨基因组DNA的含量和纯度测定3.3.3 梨特异引物PCR体系的建立3.3.4 s基因的回收纯化3.3.5 S基因的克隆3.3.6 S基因的生物信息学分析4 结果与分析4.1 梨S-基因特异引物PCR体系的建立2+的用量对特异引物PCR反应的影响'>4.1.1 Taq酶、模板DNA和Mg2+的用量对特异引物PCR反应的影响4.1.2 dNTPs和引物不同用量对反应体系的影响4.1.3 特异引物PCR反应程序的建立4.2 克隆片断回收、纯化与克隆4.3 S基因测序及分析4.3.1 S基因测序的结果4.3.2 S基因序列BLAST分析4.3.3 S基因序列CLUSTALW分析4.3.4 S基因序列的Genebank登录5 讨论5.1 克隆的S基因条带5.2 S基因特异引物PCR技术的重复性和稳定性5.3 S基因回收纯化的改进5.4 S基因克隆的优化2法制感受态细胞'>5.4.1 CaCl2法制感受态细胞5.4.2 S基因连接转化的技巧5.4.3 菌落PCR法检测6 结论6.1 建立了梨S基因的特异引物PCR最佳反应体系6.2 克隆出了砀山酥梨自然保护区17种梨的20条S基因片段6.3 S基因片断的克隆及优化6.4 S基因的生物信息学分析参考文献附录致谢作者简介
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