利用反向重复结构转基因及其侧翼序列转化获得双抗病毒转基因烟草

论文摘要

RNA沉默在植物上称为转录后基因沉默,是植物固有的一种抵御病毒侵染的机制,它可以使侵染植物的病毒的RNA发生序列特异性的降解,从而使植物获得抗性。为提高植物对病毒的抗性,人们用来源于病毒本身的基因作为转基因材料创造转基因植物。研究证明反向重复结构转基因在植物中有更多机会可以转录形成发夹结构的dsRNA,而dsRNA引发的RNA沉默在RdRp的作用下可以使沉默从双链区向连接在双链上的单链侧翼序列延伸,使双链及其连接在侧翼的单链RNA序列一起发生沉默。本研究通过分别在植物表达载体pRIR202反向重复结构的上游侧翼插入马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）CP基因全长序列构建重组表达载体pRIR202XCP、下游侧翼插入马铃薯X病毒基因组约2kb的单片段基因（包括CP基因至NIB基因的部分序列）构建植物表达载体pRIR202-P2kII,通过农杆菌介导方法转化烟草;研究由反向重复结构引起的RNA沉默能否影响到反向重复转基因结构的侧翼而获得多抗的转基因植物。研究的主要结果和结论如下:1,构建反向重复结构侧翼序列植物表达载体成功构建了植物表达载体pRIR202XCP和pRIR202-P2kII,将所构建的重组植物表达载体pRIR202XCP和pRIR202-P2kII利用液氮冻融法直接导入农杆菌LBA4404和GV3101,转化烟草,获得转基因植株。2,抗病毒转基因烟草的获得及抗病性鉴定转基因pRIR202XCP的植株获得较高抗病行的转基因烟草植株,分子杂交结果证明转基因植株的抗病性是由RNA沉默引起的,证明了由反向重复结构引发的RNA沉默可以有效的影响该重复结构上游侧翼区域而同样引发基因沉默,使转基因植株获得高度抗病性,从而获得了高抗两种病毒病的双抗转基因烟草植株。转pRIR202-P2kII基因也成功获得转基因植株,初步的检测证明外源基因已经转入烟草基因组。而针对第一批移栽苗的初步抗病性测定结果表明有76%的转基因植株表现出对病毒的抗性。初步说明RNA沉默向反向重复结构下游侧翼延伸的有效性。3,通过利用反向重复结构及其侧翼序列共沉默的效应,使所获得的转基因植物具有高抗多种病毒病的特性,更有效的抵抗田间多种病毒病混合侵染造成的经济损失。

论文目录

• 英文缩略表
• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 RNA 沉默
• 1.1.1 RNA 沉默的发现
• 1.1.2 RNA 沉默的分子机制
• 1.1.2.1 siRNA 途径
• 1.1.2.2 miRNA 途径
• 1.1.3 RNA 沉默的特点
• 1.1.4 RNA 沉默的应用前景
• 1.1.4.1 RNA 沉默技术在植物抗病毒研究中的应用
• 1.1.4.2 RNA 沉默是植物功能基因分析的一个潜在技术途径
• 1.1.4.3 基因治疗
• 1.1.4.4 基因敲除
• 1.1.4.5 研究信号传导通路的新途径
• 1.1.4.6 基因表达调控
• 1.2 病毒介导的RNA 沉默
• 1.3 传递性RNA 沉默
• 1.4 马铃薯X 病毒基因组结构与功能
• 1.4.1 病毒基因组的结构与功能
• 1.4.2 病毒的复制、表达及其调控
• 1.4.3 病毒的系统侵染
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒毒源
• 2.1.2 供试植物
• 2.1.3 菌株和载体
• 2.1.4 生化试剂
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物表达载体pRIR202 的扩繁
• 2.2.1.1 感受态细胞的制备
• 2.2.1.2 植物表达载体pRIR202 质粒转化大肠杆菌
• 2.2.1.3 碱裂解法大量提取质粒（参照《分子克隆》第三版）
• 2.2.2 植物表达载体pRIR202XCP 的构建
• 2.2.2.1 引物设计
• 2.2.2.2 目的片段XCP 的PCR 扩增（聚合酶链式反应）
• 2.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.2.4 PCR 产物XCP 单酶切与产物回收
• 2.2.2.5 反向重复载体pRIR202 的酶切与回收
• 2.2.2.6 pRIR202 载体酶切回收产物的脱磷处理
• 2.2.2.7 植物表达载体pRIR202XCP 的构建策略
• 2.2.3 PVX 目的基因P2kII 片段的获得
• 2.2.3.1 植物总RNA 的提取（Trizol 法）
• 2.2.3.2 引物设计
• 2.2.3.3 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.3.4 聚合酶链式反应（PCR 扩增）
• 2.2.3.5 琼脂糖凝胶电泳与PCR 产物回收
• 2.2.3.6 连接反应
• 2.2.3.7 碱裂解法提取质粒DNA（参照《分子克隆》第三版）
• 2.2.3.8 重组质粒pMD18-T-P2kI 鉴定
• 2.2.3.9 重组克隆质粒pMDP2kII 获得
• 2.2.4 植物表达载体pRIR202-P2kII 的构建策略
• 2.2.5 植物表达载体pRIR202XCP 与pRIR202-P2kII 向农杆菌中的转化
• 2.2.6 基因转化、植株再生及T0 代转基因植株的筛选
• 2.2.6.1 目的基因向烟草中的转化及植株再生
• 2.2.6.2 T0 代转基因植株的抗病性鉴定及ELISA 检测
• 2.2.6.3 T0 代转基因植株的总DNA 提取、PCR 鉴定
• 2.2.6.4 T0 代转基因植株的Southern blot 分析
• 2.2.6.5 T0 代转基因植株总RNA 提取及Northern blot 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体pRIR202XCP 的鉴定
• 3.1.1 PVX CP 基因的PCR 扩增结果及植物表达载体pRIR202XCP 的鉴定结果
• 3.1.2 植物表达载体pRIR202XCP 转化农杆菌的鉴定
• 3.2 植物表达载体pRIR202-P2kII 的鉴定
• 3.2.1 PVX 的P2KII 目的片段的获得
• 3.2.1.1 RT-PCR 扩增结果
• 3.2.1.2 P2KII 目的片段及重组克隆质粒pMDP2KII 的获得
• 3.2.2 重组克隆质粒pMDP2kII 的鉴定
• 3.2.2.1 重组质粒的电泳
• 3.2.2.2 重组质粒的PCR 鉴定
• 3.2.2.3 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.3 植物表达载体pRIR202-P2kII 的构建
• 3.2.3.1 重组植物表达载体pRIR202-P2kII 的PCR 鉴定
• 3.2.3.2 重组植物表达载体pRIR202-P2kII 的酶切鉴定
• 3.2.3.3 重组植物表达载体pRIR202-P2kII 转化农杆菌的PCR 筛选
• 3.3 农杆菌介导的基因转化、植株再生及T0 代转基因植株的筛选
• 3.4 T0 代转基因烟草的抗病性分析
• 3.4.1 转pRIR202XCP 的T0 代烟草的抗病性分析
• 3.4.2 转pRIR202-P2kII 的T0 代烟草的抗病性分析
• 3.5 转pRIR202-P2kII 基因植株的PCR 检测
• 3.6 转基因植物的Southern blot 分析
• 3.6.1 转pRIR202XCP 基因植物的Southern blot 分析
• 3.7 转基因植物的Northern blot 分析
• 3.7.1 转pRIR202XCP 基因植物的Northern blot 分析
• 4 讨论
• 4.1 植物表达载体的构建
• 4.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 4.3 RNA 沉默与转基因植株的抗病性
• 4.4 利用反向重复结构侧翼序列转化的研究意义
• 5 结论
• 5.1 构建反向重复结构侧翼序列植物表达载体
• 5.2 抗病毒转基因烟草的获得及抗病性鉴定
• 6 参考文献
• 附录 I 常用缓冲液及培养基的配制
• 致谢
• 硕士期间发表的学术论文
• 硕士学位论文内容简介及自评