胡杨不定根发生的细胞生理生化及其cDNA克隆研究

论文摘要

胡杨（Populus euphratica Oliver）是我国及中亚腹地干旱荒漠区中特有的珍贵森林资源,具有耐盐碱、耐旱、抗寒、抗风沙等特性,对于维持和调控干旱荒漠地区脆弱的生态平衡、改善绿洲农业生态环境具有重要意义。由于胡杨实生繁殖有限且容易造成性状分离,无性繁殖日趋显得重要。但胡杨插条繁殖生根困难,成为制约胡杨产业发展的瓶颈问题,亟待解决。论文利用胡杨不定根再生调控体系,采用显微、气质联用（GC-MS）和cDNA克隆等技术,从细胞及分子水平研究了胡杨不定根发生前后的细胞组织结构及激素、同工酶等生理生化指标的变化规律;对克隆得到的cDNA差异片段进行了生物信息学分析。研究为深入探讨胡杨不定根发生发育的分子机制,实现人为调控胡杨不定根发生奠定重要的工作基础,对胡杨种质保存和遗传改良具有重要的理论和实践意义。论文的实验结果如下:1.首次用胡杨花序为外植体建立了稳定的胡杨组织培养快繁体系。胡杨雌、雄花序诱导愈伤组织在所涉及的培养基配方内最适培养基是以B5为基本培养基,雌花序添加1.0 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA或雄花序添加1.0 mg·L-16-BA和1.0mg·L-1NAA,诱导率达98.0%,绿色愈伤组织诱导率均在63.0%以上,绿色愈伤组织与芽的形成呈正相关。愈伤组织在B5培养基上添加1.0 mg·L-1 6-BA和1.25 mg·L-1NAA或MS培养基上添加1.0 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA继代增殖较好。雌、雄花序以MS为基本培养基,添加0.5 mg·L-1 6-BA和0.2 mg·L-1 NAA,可诱导愈伤组织产生不定芽,长大的芽在1/2MS+0.5 mg·L-1 IBA可诱导生根,生根率35.0%以上。采用花序作为外植体进行组织培养再生幼苗的周期短于其它外植体近2周。2.建立了除愈伤组织以外的胡杨实生苗插穗和芽诱导不定根发生的调控培养体系,可用作研究胡杨不定根发生与形态建成的良好实验系统。观察和分析了胡杨实生苗插穗不定根发生发育的细胞组织显微和超微结构特征。胡杨插穗培养在无IBA的培养基上,36 h在维管束周围有大核细胞发生;48 h有糊粉粒积累且富含糊粉粒的细胞相对集中;60 h根原基有维管束的形成,胡杨不定根原基发生在皮层维管组织邻近的薄壁细胞（相当于髓射线部位）处;72 h生成不定根,此时,核膜完整,核比较大,核仁多呈环状结构。而插穗培养在添加了0.5 mg·L-1IBA的培养基上,根原基的形成受到抑制,插穗基部细胞脱分化,形成愈伤组织。3.利用GC-MS技术,分析了与不定根发生相关的激素的变化规律。在不定根形成过程中,内源激素IAA和ABA可作为诱导根原基发生的重要信号分子。尤其是IAA,当浓度在一定范围内且处于较稳定状态时,有利于促进不定根的发生;如果IAA浓度超过一定的阈值且不稳定,则抑制不定根的发生;IAA与其他激素如GA3和ABA等之间的比值也影响不定根的发生;当内源激素GA3处于一个较稳定状态时,有利于不定根的形成。4.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术检测到过氧化物酶（POD）2 b谱带的持续表达,它有利于根原基诱导,这与促进IBAβ氧化作用,激活抑制根生长的IAA,使其浓度达到有效的促根阈值有关。淀粉酶在60 h时表达增强,是根原基发育的标志。酯酶在根原基诱导时活性很低,而在根原基发育时则活性增强。5.采用Gene FishingTM等技术快速克隆了胡杨雌花序愈伤组织诱导不定根时应答IBA信号的差异cDNA。初步分析表明,在未加IBA的培养基上培养的愈伤组织中,克隆到可能编码水解酶的0-4基因,与抑制不定根生长密切相关。在未加IBA的培养基上培养的愈伤组织中,克隆到可能编码富含亮氨酸重复domain蛋白的0-5基因,此产物很可能参与抑制根有关的信号转导过程。在添加IBA的培养基上培养的愈伤组织中,克隆到可能编码Epidermal protein 140（RR-2家族）的1-34-1基因,此产物参与植物不定根的发育过程。6.通过对胡杨3个不定根发生调控培养体系的比较和与胡杨不定根发生可能相关的差异基因的克隆分析,初步建立IBA调控胡杨不定根发生的内源IAA阈值和激素间平衡的模型,即外源IBA通过插穗受体接收,转入细胞内并在POD酶作用下转化成具有活性的IAA,当IAA的水甲在促根的阈值内并保持相对平稳时,则有利于生根;当IAA的浓度增高超过阈值且不稳定时,则抑制不定根的发生。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 目录
• 1 引言
• 1.1 植物不定根发生与发育的研究进展
• 1.1.1 植物不定根形态建成中分生组织（干细胞）的结构与特征
• 1.1.1.1 植物干细胞与不定根发生
• 1.1.1.2 植物不定根分生组织的结构特征
• 1.1.2 外植体的生理状态对不定根发生的影响
• 1.1.3 营养元素及光对不定根的影响
• 1.1.4 激素对植物不定根发生的影响
• 1.1.4.1 生长素与不定根的形成
• 1.1.4.2 赤霉素与不定根的形成
• 1.1.4.3 脱落酸与不定根的形成
• 1.1.4.4 乙烯与不定根的形成
• 1.1.5 不定根发生过程中的其他影响因子
• 1.1.6 不定根发生过程中的信号传导
• 1.1.7 不定根发生过程中的相关基因表达与调控
• 1.2 胡杨快繁技术及不定根诱导的研究现状
• 1.2.1 不同外植体再生植株
• 1.2.2 培养基及培养环境对诱导不定芽的影响
• 1.2.3 胡杨的试管苗诱导生根
• 1.3 研究内容和意义
• 2 胡杨快繁技术及不定根发生调控体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 以胡杨花序为外植体建立组织培养快繁体系（体系1）
• 2.2.1.1 胡杨雄花序诱导愈伤组织、芽和根的培养基的筛选
• 2.2.1.2 胡杨雌、雄花序诱导愈伤组织和芽的比较
• 2.2.1.3 腺嘌呤（A）和水解乳蛋白（LH）对胡杨雌、雄花序诱导愈伤组织和芽的影响
• 2.2.1.4 胡杨雌花序诱导绿色愈伤组织、芽和根的培养基筛选
• 2.2.2 以茎段、叶片为外植体诱导愈伤组织、芽和根
• 2.2.2.1 茎段诱导愈伤组织、芽和根
• 2.2.2.2 叶片诱导愈伤组织、芽和根
• 2.2.2.3 胡杨不同外植体诱导愈伤组织和芽的比较
• 2.2.2.4 胡杨不同外植体诱导芽分化前后POD同工酶电泳图谱分析
• 2.2.3 胡杨实生苗插穗不定根发生的培养体系（体系2）
• 2.2.4 由胡杨芽直接培养建立不定根发生培养体系（体系3）
• 2.2.5 胡杨不定根发生调控培养体系间的比较
• 2.3 讨论
• 2.3.1 愈伤组织褐化的原因与改良
• 2.3.2 幼苗黄化的原因与改良
• 2.3.3 IBA与不定根发生
• 2.3.4 外植体细胞所处的状态及培养基对愈伤组织、芽诱导的影响
• 2.4 小结
• 3 胡杨不定根发生过程的分生组织结构特征
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果与分析
• 3.2.1 胡杨不定根发生过程的细胞组织解剖学特征
• 3.2.2 细胞组织化学的变化
• 3.2.3 胡杨不定根发生过程的亚细胞超微结构特征
• 3.3 讨论
• 3.3.1 糊粉粒积累、维管束形成与不定根原基发生的关系
• 3.3.2 胡杨不定根干细胞的结构特征
• 3.4 小结
• 4 胡杨不定根发生过程中内源激素和同工酶的变化及分析
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 3测定方法'>4.1.2 激素IAA、ABA、GA₃测定方法
• 4.1.3 同工酶测定方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 内源IAA对生根的影响
• 4.2.2 内源ABA对生根的影响
• 3对生根的影响'>4.2.3 内源GA₃对生根的影响
• 4.2.4 IAA/ABA对生根的影响
• 3对生根的影响'>4.2.5 ABA/GA₃对生根的影响
• 4.2.6 胡杨不定根发生过程中POD同工酶的分析
• 4.2.7 胡杨不定根发生过程中淀粉酶（AMY）同工酶的分析
• 4.2.8 胡杨不定根发生过程中酯酶（EST）同工酶的分析
• 4.3 问题与讨论
• 4.3.1 生长素诱导胡杨不定根发生的作用
• 4.3.2 ABA和GA对胡杨不定根发生的作用
• 4.3.3 胡杨不定根发生困难的原因
• 5 胡杨雌花序愈伤组织诱导不定根过程中差异cDNA克隆与分析
• 5.1 实验材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 试剂及溶液配制
• 5.1.3 仪器设备
• 5.1.4 实验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 IBA诱导不定根的效应
• 5.2.2 Trizol法和CTAB法提取总RNA的效果比较
• 5.2.3 差异条带的PCR扩增
• 5.2.4 单克隆菌落PCR鉴定
• 5.2.5 差异cDNA片段序列和蛋白质序列及比对分析
• 5.3 小结
• 6 结论
• 7 创新点与研究展望
• 参考文献
• 图版
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢