白腐菌混合培养产漆酶及其机制和脱色效果研究

论文摘要

微生物混合培养或混合发酵比纯培养更快、更有效。混合培养虽然得到许多肯定,取得了许多成果,并应用于实践,但对于混合培养体系的作用机理和相互关系的研究甚少,以至于目前对于混合菌株对的筛选和组合还具有很大的随机性。白腐菌是产漆酶的主要菌株,而漆酶在造纸、食品、纺织工业等方面都有比较广泛的应用。本实验室筛选到高产漆酶菌株杂色云芝Coriolus versicolor Lz-8。将其种子培养基和实验室筛选到的其他11株产漆酶菌株和纤维素酶菌株进行混合发酵产酶。结果显示,第七天时Lz-8和层孔菌W1混合所产漆酶是Lz-8单独所产漆酶的1.6倍左右。对两种菌的接种比例和接种时间的研究表明:接种比例为1:1时,漆酶在第九天平均可达到最高值40.96 IU/ml,分别是Lz-8和W1单独培养产漆酶的3.35和4.84倍。而在W1提前一天接种时效果最好,第九天漆酶酶活分别是Lz-8和W1单独培养的3.64和4.87倍。而通过平板共同培养发现:两菌在平板上能够很好的共生。且在交接处有明显的分界线并有色素产生。对混合培养所产的漆酶粗酶液的酶学性质研究表明:该酶的最适pH为2.5左右,在pH5.0-9.0的范围内,24小时后酶活仍然能达到初始的85%左右。最适温度在55℃,在50℃和60℃条件下保温,稳定后酶活分别达到初始的53%和36%左右,70℃和80℃条件下,则只有初始的2%-4%。Lz-8和W1于5 L发酵罐中进行混合培养产酶,结果显示仍然可以达到较高的酶活,说明该方法有一定的可行性和实际应用的潜力。对Lz-8和W1单独培养不同天数所产酶液,分别采用不同比例进行混合,发现直接混合的酶液并没有酶活提高的现象,说明混合培养酶活的提高并不是由于两种酶液存在正协同作用。在培养生长的前期内,分别将Lz-8和W1单独培养不同天数的发酵液按照1:1混合后继续混合培养,结果显示:第3天或第4天混合的发酵液,分别在混合的第2天酶活就有很大的提升,这表明刺激酶活提高的物质可能产生于第3天或第4天的发酵液中。对Lz-8和W1单独培养第4天的发酵液进行过滤以除去菌体影响,分别加到对方第四天的含有菌体的发酵液中继续培养。结果加入了W1过滤发酵液的Lz-8培养基,在第5天时的酶活是第4天时酶活的一倍多,而W1的培养基产酶情况没有明显变化。表明是W1发酵液中产生了某种或某类物质,刺激了Lz-8的产酶。而分别对混合培养,Lz-8和W1的粗酶液进行活性染色,发现三种粗酶液显色条带有明显的不同。将混合培养所产的漆酶粗酶液在0.58 IU/ml的用量下对RBBR、溴酚蓝、孔雀绿、罗丹明B、结晶紫和甲基橙进行脱色实验,其中以RBBR和溴酚蓝脱色效率最高,1小时内脱色率就达到90%左右。对处理这两种染料的温度、转速和染料浓度进行的实验表明:混合培养产生的粗酶液对这些因素并不敏感,在20-70℃,0-180 rpm,染料浓度200-600 mg/l的条件下,RBBR和溴酚蓝的脱色率在100 min内均分别达到96%和92%以上。而对处理前后的染料进行可见光扫描显示,处理后染料的特征吸收完全消失。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 微生物混合培养的研究概况
• 1.2 漆酶（laccase）介绍
• 1.2.1 漆酶的结构及特性
• 1.2.2 漆酶的作用机制
• 1.2.3 常用的漆酶产生菌
• 1.2.4 漆酶的研究及应用
• 1.3 染料介绍
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 混合培养菌株对的筛选及培养条件的优化
• 2.1 导言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株培养
• 2.2.2 菌株对的筛选
• 2.2.3 漆酶粗酶液制备及酶活测定
• 2.2.4 平板培养观察
• 2.2.5 接种比例的优化
• 2.2.6 接种时间的优化
• 2.2.7 混合培养碳源和氮源的优化
• 2.2.8 发酵罐产酶
• 2.2.9 主要仪器和药品
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 混合培养促进产酶的菌株筛选
• 2.3.2 菌株相互关系形态观察
• 2.3.3 混合培养条件优化
• 2.3.3.1 最适混合比例
• 2.3.3.2 最适混合时间
• 2.3.3.3 最佳碳源种类和浓度
• 2.3.3.4 最佳氮源种类和浓度
• 2.3.4 发酵罐培养产酶曲线
• 2.4 小结
• 第三章 混合培养产粗酶液性质和产酶相互作用的初步研究
• 3.1 导言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株培养
• 3.2.2 粗酶液的制备和酶活测定
• 3.2.3 最适pH和pH稳定性研究
• 3.2.4 最适温度和温度稳定性研究
• 3.2.5 Lz-8和W1酶液协同作用的研究
• 3.2.6 Lz-8和W1产酶相互作用的研究
• 3.2.7 活性染色
• 3.2.8 主要仪器和试剂
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 最适pH和pH稳定性
• 3.3.2 最适温度和温度稳定性
• 3.3.3 酶液协同作用的研究
• 3.3.4 产酶相互作用的研究
• 3.3.5 纯培养和混合培养酶液显色条带的差异
• 3.4 小结
• 第四章 混合培养粗酶液对染料的脱色作用
• 4.1 导言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌体培养
• 4.2.2 粗酶液的制备和酶活测定
• 4.2.3 粗酶液处理不同染料的效果
• 4.2.4 处理前后的RBBR和溴酚蓝可见光波长扫描
• 4.2.5 不同转速处理RBBR和溴酚蓝
• 4.2.6 不同染料浓度下处理RBBR和溴酚蓝
• 4.2.7 不同温度处理RBBR和溴酚蓝
• 4.2.8 主要仪器和试剂
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 六种染料的特征吸收
• 4.3.2 粗酶液处理六种染料的效果比较
• 4.3.3 转速对RBBR和溴酚蓝脱色率的影响
• 4.3.4 染料浓度对RBBR和溴酚蓝脱色率的影响
• 4.3.5 温度对RBBR和溴酚蓝脱色率的影响
• 4.3.6 RBBR和溴酚蓝处理前后400-700nm吸收变化
• 4.4 小结
• 总结
• 后续工作展望
• 参考文献
• 致谢