增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体蛋白质组及其分子标志物的研究

论文摘要

目的增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）是导致视网膜脱离手术失败最主要的原因。本研究利用蛋白质组学平台,对原发性孔源性视网膜脱离伴PVR的玻璃体蛋白质组进行分离和鉴定,建立PVR和正常眼玻璃体蛋白质组图谱,筛选能评估术前PVR严重程度和手术预后的血清分子标志物。方法（1）二维液相色谱联合串联质谱（two-dimensional-liquid chromatography coupled by tandem mass spectrometry, 2D-LC-MS/MS）分离和鉴定PVR玻璃体的蛋白质组:收集PVRB、C、D级患者的玻璃体原液和术前血清,正常捐献眼玻璃体和健康人的血清为对照组。将相同等级的轻度PVR（PVRB级）和严重PVR（PVRC、D级）以及捐献眼玻璃体样本等量混合,丙酮沉淀过夜。重溶后测蛋白质浓度,加入胰酶,37℃酶解过夜。过阳离子交换柱后进行在线反向色谱,纳喷雾质谱鉴定,MASCOT数据库检索。（ 2 ）双向凝胶电泳（ two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ ionization - time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）对PVR与正常玻璃体的差异蛋白质组研究:实验样本同（1）。将同一等级的玻璃体样本等量混合,丙酮沉淀过夜。再水化液重溶后,加至固相pH梯度凝胶电泳胶条（18 cm,pH3-10）进行水化,等电聚焦,100 V/30 min,3500 V/ 4 h,8000 V/4 h。平衡后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,30 mA / 6 h。银染后图像分析。差异明显（至少2倍以上的吸光度OD）的蛋白质点进行胶内酶解,质谱鉴定后MASCOT数据库检索。（3）激肽原1在PVR玻璃体和血清中的验证:PVR B、C、D级和正常捐献眼玻璃体样本和相应的血清样本同（1）。同时,收集PVR A级的玻璃体和术前血清样本以及PVR术后不同状态的血清样本,包括环扎术后未愈者和硅油眼。对玻璃体和相应的血清样本分别进行激肽原1的免疫印记分析（western blotting analysis, WB）和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。（4）类胰岛素生长因子结合蛋白-6 （insulin-like growth factor binding protein,IGFBP-6）在PVR的玻璃体和血清中的验证:实验样本同（3）。应用WB和ELISA对玻璃体和相应的血清样本进行验证。结果（1）在捐献眼、轻度和严重PVR玻璃体中分别鉴定到129、97和137种蛋白质。其中,35种为三者共有的蛋白质,24种为PVR玻璃体特异蛋白质。血浆中的高丰度蛋白质,如丝氨酸蛋白酶抑制剂家族、补体成分等和一些细胞外蛋白质在PVR玻璃体中明显上调或增加;同时细胞骨架蛋白质微管蛋白以及参与糖酵解的酶,如丙酮酸激酶和烯醇化酶等在PVR中明显下调。在PVR特异的蛋白质中,激肽原1是鉴定到的肽段数较多大的相对高丰度蛋白质;而IGFBP-6与增殖的信号转导有关。（2）捐献眼、轻度PVR和严重PVR玻璃体2-DE图谱分别分析到47、184和336个蛋白质点,在13个明显差异蛋白质中成功的鉴定到7种蛋白质。其中,烯醇酶2是捐献眼特有的;甲状腺激素结合蛋白单体和视黄醇结合蛋白（retinol-binding protein,RBP）单链是在严重PVR玻璃体中特异的蛋白质;前列腺素D合成酶和RBP3前体是捐献眼和PVR眼玻璃体共有的蛋白质,轻度PVR时明显增加,严重PVR时下调。血清白蛋白和转铁蛋白,随PVR严重程度增加而明显上调。（3）WB显示激肽原1在PVR患者玻璃体和血清中检测到而在正常捐献眼和正常人的血清中未测到,且在PVRC、D级中明显高于PVRB级。激肽原1可以在所有的PVR患者玻璃体和血清样本中检测到（24/24, 100%）。ELISA显示严重PVR患者玻璃体和血清中激肽原1明显高于轻度PVR（P<0.05）。PVR患者术后6个月血清中激肽原1明显下降（P<0.05）,仍高于正常对照组（P<0.05）。但环扎术后未愈者血清中激肽原1明显高于正常对照组和硅油眼（P<0.01）,亦高于玻切术后6个月随访组（P<0.05）。（4）WB显示,IGFBP-6在PVR的玻璃体和血清中检测到而在正常捐献眼和正常人血清中未测到,且在PVRC、D级中明显高于PVRB级。IGFBP-6可以在91.7%的PVR患者玻璃体和血清样本中检测到（除外2个PVRB样本）。ELISA显示严重PVR患者的玻璃体和血清中IGFBP-6明显高于轻度PVR（P<0.05）。PVR患者术后6个月血清中IGFBP-6的浓度明显下降（P<0.05）,与玻璃体术后硅油眼和正常对照组的血清中的浓度接近（P>0.05）,但明显低于环扎术后未愈组（P<0.05）。结论（1）本研究提示PVR是一个复杂的病理过程,玻璃体发生一系列的变化,有大量的新生蛋白质生成、血浆蛋白质的侵入以及正常玻璃体的蛋白质降解,证实了PVR的病程中存在血-视网膜屏障的破坏、细胞骨架的重塑、细胞免疫反应参与以及玻璃体的能量代谢障碍。（2）2D-LC-MS/MS和2-DE-MALDI-TOF-MS蛋白质策略的联合应用可以互为补充,能够更完整的揭示差异蛋白质组的研究（。3）激肽原1和IGFBP-6是候选的PVR血清分子标志物,可用于PVR严重程度的临床分级和预后评价指标,并为预防PVR的药物开发提供了新的靶向,有一定的临床应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 二维液相色谱联合质谱分离和鉴定增生性玻璃体视网膜病变玻璃体的蛋白质组
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 双向凝胶电泳对增生性玻璃体视网膜病变与正常玻璃体的差异蛋白质组研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 激肽原1 在增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体和血清中的验证
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 类胰岛素生长因子结合蛋白-6 在增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体和血清中的验证
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述一 蛋白质组学研究技术及其联合应用
• 参考文献
• 综述二 蛋白质组学在眼疾病中的应用进展
• 参考文献
• 附表
• 博士期间发表论文情况
• 致谢