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苏姜猪初情期启动基因的发育性变化及差异显示研究

2020-12-07阅读(121)

苏姜猪初情期启动基因的发育性变化及差异显示研究

论文摘要

初情期是动物首次出现发情排卵的年龄,是开始获得繁殖能力的标志。初情期的启动,是由下丘脑GnRH神经元控制。从目前的研究报道看,初情期启动的机制实际上是GnRH脉冲式释放的调控,是非类固醇介导的中枢机制,调控因素包括神经肽、神经递质、神经类固醇。主要参与调控GnRH释放的神经肽有鸦片肽、NPY、促生长激素神经肽（Galanin）、促皮质激素释放激素（CRF）；神经递质有去甲肾上腺素（NE）、多巴胺、5-羟色胺、褪黑激素、Y氨基丁酸（GABA）,但其具体调控机制还需进一步研究探讨。目前,关于初情期启动相关基因受体NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的研究报道较少,特别是关于他们对初情期启动的调控机制几乎没有报道。本研究系统的研究初情期启动相关基因受体NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因在下丘脑-垂体-卵巢内的组织定位及其组织发育性变化,目的是为深入研究探讨NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb在初情期启动中扮演的角色。同时本实验还采用mRNA差异显示（mRNA DD）技术对猪初情期启动的关键因子做进一步的研究,以筛选与猪初情期启动相关的重要基因。主要研究结果如下：1.根据GenBank发表的序列设计NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因特异性引物,采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的部分cDNA序列,扩增产物克隆入pGEM-T easy载体中进行序列测定。结果：与发表的猪NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因序列（NO.AF106081,NO.DQ459346,NO.AF092422）同源性均为100%,说明所扩增的序列为本实验所要的,为后续研究奠定了基础。2.用原位杂交技术检测苏姜猪母猪初情期前后NPY-Y1 mRNA在下丘脑、垂体和卵巢的分布定位。结果：在苏姜猪初情期前后下丘脑、垂体和卵巢三种组织中,均检测到NPY-Y1 mRNA阳性杂交信号。下丘脑的阳性杂交信号主要集中在丘脑室旁核和下丘脑的弓状核、室旁核、室周核等处；在垂体中分布相对密集；各级卵泡颗粒细胞和内膜细胞中均有阳性杂交信号,间质中也有少量的杂交信号。在三种组织中NPY-Y1 mRNA杂交信号均初情期较弱,初情期前相对较强。结果可以初步证明NPY-Y1在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中具有关键的调控作用,并且对下丘脑-垂体-卵巢轴具有调控作用。3.用原位杂交技术检测苏姜猪母猪初情期前后GPR54 mRNA在下丘脑、垂体和卵巢的分布定位。结果：在苏姜猪初情期前后下丘脑、垂体和卵巢三种组织中,均检测到GPR54 mRNA阳性杂交信号。下丘脑的阳性杂交信号主要集中在弓状核和腹内侧核中,其它区也有一定的表达；在垂体中分布相对密集；各级卵泡颗粒细胞和内膜细胞中均有阳性杂交信号,间质中也有少量的杂交信号,大卵泡的阳性率明显高于小卵泡。在三种组织中GPR54 mRNA杂交信号均初情期较强,初情期前相对较弱些。结果可以初步证明GPR54在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中具有关键的调控作用,并且对下丘脑-垂体-卵巢轴具有调控作用。4.用免疫组织化学的方法测定苏姜猪母猪初情期前后下丘脑、垂体、卵巢内Ob-Rb的分布及定位。结果：Ob-Rb阳性颗粒广泛分布于下丘脑,尤其是弓状核；垂体中Ob-Rb阳性颗粒主要集中于垂体前叶细胞；卵巢中Ob-Rb阳性颗粒出现在各级卵泡的颗粒细胞,而卵母细胞没有阳性颗粒。结果可以初步证明Ob-Rb在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性生殖的调节中也具有关键的调控作用。5.用荧光定量PCR技术检测苏姜猪初生、60、120、初情期、180日龄五个不同发育阶段的下丘脑、垂体和卵巢三种组织中NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb mRNA的表达丰度变化。结果：（1）下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA表达量从初生到初情期表达量逐渐下降,在初情期达到最低,初情期后呈上升趋势。下丘脑内各个时期NPY-Y1 mRNA表达量均存在显著差异（P<0.05）,垂体内120日龄与180日龄之间NPY-Y1 mRNA表达量差异不显著（P>0.05）,其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异（P<0.05）,卵巢内初情期与180日龄之间NPY-Y1 mRNA表达量差异不显著（P>0.05）,其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异（P<0.05）。（2）下丘脑、垂体与卵巢内GPR54 mRNA表达量均从初生到初情期表达量逐渐上升,在初情期达到最高,初情期后呈下降趋势。下丘脑内初情期与初生、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平（P<0.05）,垂体内初情期与初生、60日龄、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平（P<0.05）,卵巢内初情期与初生、60日龄、120日龄、180日龄的GPR54 mRNA表达量差异均达到显著水平（P<0.05）。（3）下丘脑、垂体与卵巢内Ob-Rb mRNA发育性变化模式与NPY-Y1基本相同,从初生到初情期表达量逐渐下降,在初情期达到最低,初情期后呈上升趋势。下丘脑内120日龄、初情期与180日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著（P>0.05）,其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异（P<0.05）,垂体内60日龄与120日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著（P>0.05）,其它时期NPY-Y1 mRNA表达量均显著差异（P<0.05）,卵巢内初情期与180日龄之间Ob-Rb mRNA表达量差异不显著（P>0.05）,其它时期Ob-Rb mRNA表达量均显著差异（P<0.05）。结果初步显示了三种受体在猪下丘脑-垂体-卵巢生殖轴中不同发育时期的变化,并且证明发育时期中NPY对GnRH释放起到是抑制作用,而leptin对GnRH起释放作用,低剂量的leptin可促进GnRH-LH的分泌,高浓度则抑制其分泌,这为以后的研究提供了可靠的科学数据。6.采用mRNA差异显示技术、Reverse Northern技术以及半定量分析技术,对不同发育时期猪下丘脑差异表达的ESTs进行分离,共得到cDNA差异片断20条,半定量分析显示：其中5条差异条带在出生时呈表达增强相,11条差异条带在初情期时呈表达增强相,其余4条在性成熟时呈表达增强相。测序结果与GenBank数据库比对,二个cDNA与已知基因同源,其余大部分都是功能未知的EST序列。经Reverse Northern验证,有9个cDNA呈阳性,可用于下一步探针定位及表达的研究。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 一、初情期启动相关基因的研究进展
  • 1 初情期启动的概述
  • 2 NPY的研究进展
  • 2.1 NPY的发现
  • 2.2 NPY结构及分布
  • 2.3 NPY受体
  • 2.4 NPY的生物学功能
  • 3 瘦素的研究进展
  • 3.1 leptin研究的历史
  • 3.2 leptin的结构与功能
  • 3.3 leptin与能量平衡
  • 3.4 leptin与生殖激素
  • 3.5 leptin与生殖发育
  • 3.6 leptin与初情期启动
  • 3.7 leptin受体的研究
  • 4 GPR54的研究进展
  • 4.1 GPR54的发现与分子结构
  • 4.2 GPR54的分布
  • 4.3 GPR54的信号转导途径
  • 4.4 GPR54对动物生殖的影响
  • 二、差异显示技术及其在动物繁殖新技术上的应用进展
  • 1 DDRT-PCR的原理
  • 2 DDRT-PCR的引物设计
  • 2.1 锚定引物
  • 2.2 随机引物
  • 3 DDRT-PCR参数的优化
  • 3.1 保证起始（模板）mRNA的质量与浓度
  • 3.2 降低dNTP浓度
  • 3.3 选择最适的反转录和PCR退火温度
  • 4 DDRT-PCR假阳性的鉴定方法
  • 5 应用非放射性同位素mRNA差异显示技术
  • 6 DDRT-PCR的发展
  • 7 DDRT-PCR的优点与局限性
  • 8 DDRT-PCR技术在猪繁育方面的应用
  • 8.1 在猪初情期启动方面的应用
  • 8.2 在猪胚胎、个体发育研究中的应用
  • 8.3 在猪繁殖方面的应用
  • 三、研究目的与意义
  • 第二章 猪NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的克隆与分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验动物
  • 1.1.2 质粒、菌株
  • 1.1.3 主要试剂
  • 1.1.4 主要仪器
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 实验前准备工作
  • 1.2.2 样品的采集
  • 1.2.3 RNA的提取与检测
  • 1.2.4 RT-PCR
  • 1.2.5 PCR反应
  • 1.2.6 克隆测序
  • 1.2.7 序列分析
  • 1.3 相关软件
  • 2 结果与分析
  • 2.1 总RNA的检测
  • 2.2 NPY-Y1基因的克隆与分析
  • 2.2.1 NPY-Y1基因的扩增
  • 2.2.2 NPY-Y1基因测序
  • 2.2.3 NPY-Y1基因序列分析
  • 2.3 GPR54基因cDNA的克隆与序列分析
  • 2.3.1 RT-PCR结果
  • 2.3.2 GPR54基因测序
  • 2.3.3 GPR54基因序列分析
  • 2.4 Ob-Rb基因的克隆与分析
  • 2.4.1 Ob-Rb基因的扩增
  • 2.4.2 Ob-Rb基因测序
  • 2.4.3 Ob-Rb基因序列分析
  • 3 讨论
  • 3.1 高保真Pfu的忠实性
  • 3.2 初情期启动的相关激素、肽和神经递质
  • 3.3 NPY-Y1基因
  • 3.4 GPR54基因
  • 3.5 Ob-Rb基因
  • 第三章 猪初情期前后相关基因在下丘脑-垂体-卵巢轴内的表达定位
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 1.4 样品的采集
  • 1.5 冰冻切片的制备
  • 1.5.1 器皿处理
  • 1.5.2 载玻片包被
  • 1.5.3 切片
  • 1.6 原位杂交（ISH）
  • 1.7 免疫组化
  • 2 结果与分析
  • 2.1 NPY-Y1在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位
  • 2.1.1 下丘脑内NPY-Y1 mRNA原位杂交定位
  • 2.1.2 垂体内NPY-Y1 mRNA原位杂交定位
  • 2.1.3 卵巢内NPY-Y1 mRNA原位杂交定位
  • 2.2 GPR54在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位
  • 2.2.1 下丘脑内GPR54 mRNA原位杂交定位
  • 2.2.2 垂体内GPR54 mRNA原位杂交定位
  • 2.2.3 卵巢内GPR54 mRNA原位杂交定位
  • 2.3 Ob-Rb在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位
  • 2.3.1 下丘脑内Ob-Rb的免疫组化定位
  • 2.3.2 垂体内Ob-Rb的免疫组化定位
  • 2.3.3 卵巢内Ob-Rb的免疫组化定位
  • 3 讨论
  • 3.1 下丘脑-垂体-卵巢轴调控
  • 3.2 初情期前后NPY-Y1 mRNA在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位
  • 3.3 初情期前后GPR54 mRNA在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位
  • 3.4 初情期前后Ob-Rb在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位
  • 第四章 猪NPY-Y1、GPR54、OB-Rb在下丘脑-垂体-卵巢内的发育性变化研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 实验动物
  • 1.1.2 质粒、菌株
  • 1.1.3 主要试剂
  • 1.1.4 主要仪器
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 样品的采集
  • 1.2.2 RT-PCR应用的引物序列
  • 1.2.3 RNA的提取与检测
  • 1.2.4 cDNA的合成
  • 1.2.5 实时荧光定量标准品的克隆
  • 1.2.6 荧光定量标准曲线的制备
  • 1.2.7 样品中β-actin、猪NPY-Y1、GPR54与Ob-Rb基因的检测
  • 1.2.8 统计分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 RNA鉴定
  • 2.2 基因扩增与克隆测序
  • 2.3 QRT-PCR结果
  • 2.4 下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA表达实时荧光定量检测
  • 2.5 下丘脑、垂体与卵巢内GPR54 mRNA表达实时荧光定量检测
  • 2.6 下丘脑、垂体与卵巢内Ob-Rb mRNA表达实时荧光定量检测
  • 3 讨论
  • 3.1 荧光定量PCR技术
  • 3.2 动物初情期的启动
  • 3.3 下丘脑-垂体-卵巢内NPY-Y1 mRNA的发育性变化
  • 3.4 下丘脑-垂体-卵巢内GPR54 mRNA的发育性变化
  • 3.5 下丘脑-垂体-卵巢内Ob-Rb mRNA的发育性变化
  • 3.6 NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的表达的相关性
  • 3.6.1 NPY与GnRH脉冲释放
  • 3.6.2 leptin与GnRH脉冲释放
  • 第五章 应用差异显示技术对猪初情期启动关键因子的研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要引物
  • 1.4 组织总RNA的提取
  • 1.5 反转录——cDNA第一链的获得
  • 1.6 DDRT-PCR
  • 1.7 琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 1.7.1 1%琼脂糖凝胶电泳
  • 1.7.2 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 1.7.3 凝胶的银染处理
  • 1.8 差异片段的回收及二次PCR
  • 1.8.1 差异片段的回收—煮沸法
  • 1.8.2 二次PCR
  • 1.8.3 二次PCR产物的克隆
  • 1.9 Reverse Northern杂交法剔除猪下丘脑内ESTs的假阳性
  • 1.10 半定量法检测ESTs在不同发育时期猪下丘脑内的表达
  • 2 结果与分析
  • 2.1 总RNA样品制备的结果
  • 2.2 DDRT-PCR结果
  • 2.3 差异片段回收及二次PCR
  • 2.4 Reverse Northern杂交剔除假阳性干扰
  • 2.5 差异片段测序及比对
  • 2.6 半定量RT-PCR检测差异条带的表达
  • 3 讨论
  • 3.1 反应所用引物的筛选
  • 3.2 反应条件对试验结果的影响
  • 3.3 不同差异条带回收的方法对获得差异表达ESTs的量的变化
  • 3.4 采用改进后的差异显示技术对本实验结果的影响
  • 3.5 采用半定量技术对本实验结果的影响
  • 3.6 差异序列的生物信息学分析
  • 3.6.1 MS01功能预测
  • 3.6.1.1 TLR在中枢神经系统的表达
  • 3.6.1.2 Toll介导的信号转导
  • 3.6.2 MS02功能预测
  • 3.6.3 MS03功能预测
  • 3.6.4 MS04、MS05、MS06功能预测
  • 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢

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