高纯度人胰岛素的酶促半合成与分离纯化

论文摘要

胰岛素是人体内主要调节血糖的激素,对于治疗糖尿病有特效。胰岛素的免疫原性与它的纯度及种属密切相关,其抗原性会导致一系列副作用,对糖尿病的控制及其并发症的发生、发展和预后均有一定的不良影响。要从根本上消除胰岛素的抗原性,就需要提供高纯度的人胰岛素。基因工程技术和酶促半合成是制备人胰岛素的两条可行途径,而后一种方法相对来说较为简便有效、经济实用。本论文进行了人胰岛素的一步法酶促半合成研究,并通过分离纯化来制备高纯度人胰岛素。 猪胰岛素与人胰岛素的差别仅为B链30位一个氨基酸不同,猪胰岛素为丙氨酸,人胰岛素为苏氨酸。本论文以猪胰岛素和苏氨酸叔丁酯为原料,通过酶促反应使B30丙氨酸换为苏氨酸叔丁酯,合成人胰岛素酯。然后通过阴离子交换柱分离纯化人胰岛素酯。再将人胰岛素酯脱保护,除去末端的叔丁基,即可得到人胰岛素。通过以下几种方法对制备的人胰岛素进行鉴定:用PAGE、SDS-PAGE的方法对制备的人胰岛素进行蛋白电泳,均得到与标准品同一位置的单一条带;对制备的人胰岛素酯、人胰岛素分别进行C末端鉴定,得到与苏氨酸叔丁酯、苏氨酸对应层析位置的氨基酸;用HPLC法检测自制人胰岛素和标准品人胰岛素的保留时间,得到两者的保留时间一致。这些实验结果证明了所制备的蛋白即为人胰岛素,并且测得合成得率达38.4%,纯度高达97%。另外本文还采用壳聚糖通过戊二醛固定酶,制得固相酶,催化人胰岛素酯的制备,研究固相酶促半合成人胰岛素的制备。利用人胰岛素酯与猪胰岛素疏水性的差别,率先用疏水柱对人胰岛素酯进行分离纯化,取得较好的分离效果。最后用小鼠血糖法对自制人胰岛素的效价进行测定,其效价为20.6u/mg。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述 高纯度人胰岛素制备及其生物学特性的研究进展
• 1 单组分人胰岛素研制的意义
• 2 单组分人胰岛素的研制进展
• 2.1 半合成人胰岛素的制备
• 2.2 生物合成人胰岛素的制备
• 2.3 半合成人胰岛素与基因工程生物合成人胰岛素的比较
• 2.4 单组分人胰岛素的分离纯化
• 3 人胰岛素的生物学特性
• 3.1 抗原性
• 3.2 机体对MC-HI的吸收
• 3.3 MC-HI的临床应用
• 4 胰岛素制剂发展展望
• 5 小结
• 参考文献
• 第二部分 实验研究报告
• 第一章 设计思路与实验方案
• 1 实验目的、意义
• 2 设计思路和方案
• 3 实验内容框架
• 第二章 可溶性酶一步法半合成人胰岛素的制备与鉴定
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器与用品
• 2 实验方法
• 2.1 异丁烯液体的制备
• 2.2 苏氨酸叔丁酯的制备
• t）OBu^t'>2.3 纸层析法鉴定Thr（Bu^t）OBu^t
• 2.4 一步法酶促半合成人胰岛素酯制备
• 2.5 人胰岛素酯制备反应条件筛选
• 2.6 放大实验反应体系
• 2.7 阴离子交换柱分离纯化HI-ester
• 2.8 人胰岛素的制备
• 2.9 人胰岛素酯、人胰岛素的PAGE电泳鉴定
• 2.10 人胰岛素的PAGE、SDS—PAGE鉴定
• 2.11 C末端鉴定
• 2.12 HPLC鉴定HI
• 3 实验结果
• t）OBu^t的制备结果'>3.1 Thr（Bu^t）OBu^t的制备结果
• 3.2 SDS—PAGE、PAGE电泳结果图
• 3.3 人胰岛素酯制备反应条件筛选结果
• 3.4 放大实验反应体系
• 3.5 阴离子交换分离纯化结果
• 3.6 人胰岛素酯、人胰岛素的PAGE电泳鉴定结果
• 3.7 人胰岛素的PAGE、SDS—PAGE鉴定结果
• 3.8 C末端鉴定结果
• 3.9 HPLC鉴定HI结果
• 4 结论
• 第三章 固相酶一步法半合成反应的研究
• 1 实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 壳聚糖固定化酶的制备
• 2.2 固相酶催化合成人胰岛素酯反应条件筛选
• 2.3 疏水柱分离HI—E
• 3 实验结果
• 3.1 壳聚糖固定化酶的制备结果
• 3.2 固相酶催化合成人胰岛素酯反应条件筛选结果
• 3.3 疏水柱分离HI—E结果
• 4 实验分析
• 5 结论
• 第四章 人胰岛素活性的检测
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器与用品
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 实验分析
• 5 结论
• 参考文献