H5N1亚型禽流感病毒弱毒活疫苗株构建及在不同动物模型上免疫效力的评价

论文摘要

H5N1亚型禽流感病毒不仅能感染家禽和野鸟,同时也能感染哺乳动物和人。目前,H5N1亚型禽流感病毒已经在14个国家引起300多人感染,死亡率超过50%,这对公共卫生构成了巨大威胁。研制安全有效、能够在短时间内完成大规模生产制备的大流行储备疫苗迫在眉睫。A/Ann Anbor/6/60 ca（H2N2）（简称AA/ca）冷适应致弱病毒具有冷适应性（cold-adapted, ca）和温度敏感性（temperature-sensitive,ts）,感染复制局限于上呼吸道,可直接鼻腔喷入接种,免疫原性良好,且具有高度生物安全性。AA/ca的ca和ts特性完全由六个内部基因决定。利用AA/ca作为内部基因供体研制出来的人类H1N1亚型、H3N2亚型人流感疫苗（Flumist）已经获得了临床应用。与传统灭活疫苗相比,冷适应流感疫苗的优势不仅仅体现在交叉免疫保护能力强、有效免疫保护持续时间长和接种途径方便等方面,而且有可能突破前者作为H5禽流感大流行疫苗存在的关键瓶颈,即灭活疫苗大规模生产所需原材料的短缺与制备时间漫长的制约。本研究以AA/ca疫苗为6个内部基因（PB2,PB1,PA,NP,M和NS）供体,以我国流行的抗原性具有代表性的H5N1亚型禽流感病毒,A/Anhui/2/2005 （我国人禽流感分离株,简称AH/05）、A/bar-headed/Qinghai/3/2005（目前亚洲、欧洲和非洲流行分布最广的候鸟传播代表株,简称BHG/05）为表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因供体,同时删除了高致病力相关的HA裂解位点多个碱性氨基酸,通过流感病毒反向遗传操作,在符合人类疫苗生产标准的低代次Vero细胞上救获了2株基因重配病毒,分别命名为AH/AAca和BHG/AAca。实验证实,2株病毒均具有体外培养ca和ts特性,在鸡体内不能有效复制,只能在小鼠呼吸系统内复制,呈典型的冷适应低致病力表型。进一步利用BALB/c小鼠模型评价2株冷适应基因重配病毒的免疫原性和攻毒保护效力。AH/AAca和BHG/AAca分别以106EID50（鸡胚半数感染量）剂量经鼻腔途径一次免疫小鼠,均诱导产生显著的血凝抑制（HI）抗体和中和抗体（NT）的抗体反应;间隔4周相同剂量和途径加强免疫后,均诱导产生显著增强的HI和NT抗体反应效应。AH/05和BHG/05分别作为HA和NA抗原同源病毒或异源病毒,以102MLD50（小鼠半数致死量）经鼻腔感染途径,分别于一次免疫后第4周和二次免疫后第4周进行攻毒保护试验。AH/AAca和BHG/AAca一次免疫小鼠和二次免疫小鼠,对AH/05和BHG/05分别致死攻击均产生100%的发病和死亡保护;病毒分离和滴定试验表明,一次免疫小鼠用同源病毒攻击后第3天,鼻甲骨、肺、脑、脾和肾等器官组织均未检测到病毒复制,异源病毒攻击后仅在鼻甲骨和肺脏检测到低滴度复制病毒,而未免疫对照小鼠上述器官均检测到高滴度的复制病毒;二次免疫小鼠无论同源病毒、异源病毒攻击后第3天,上述组织器官均未检测到病毒复制。为进一步评估H5N1冷适应基因重配病毒作为人类大流行储备疫苗的应用前景,采用已建立的灵长类实验动物模型,进行了系统的免疫保护效力试验。AH/AAca按107EID50剂量鼻腔途径间隔4周两次免疫接种8只猕猴（Macaca mulatta）,另外8只猕猴以相同的途径接种PBS为对照。一次免疫及二次免疫后,所有猕猴均未发现任何临床异常表现。一次免疫后第4周,所有8只免疫猕猴均检测到对同源病毒AH/05显著的NT抗体反应,并有5只检测到HI抗体反应;二次免疫后第2周,HI和NT抗体滴度均表现出显著的增强免疫效应,所有免疫猕猴均检测到高滴度NT和HI抗体。对异源病毒BHG/05的NT和HI抗体滴度较同源病毒低2-4倍。所有对照猕猴均未检测到NT和HI抗体反应。二次免疫后第3周,免疫和对照猕猴分别以AH/05和BHG/05按106EID50剂量经气管内接种途径攻击。结果显示,所有免疫猕猴经同源或异源病毒攻击后临床观察均未见有异常,而对照猕猴攻毒后均出现食欲下降和体温升高等临床症状。病毒分离和滴定试验表明,免疫猕猴无论同源或异源病毒攻击后第3天及第14天,扑杀采集呼吸系统不同部位组织,均未分离到复制病毒,组织病理学检查仅有轻度支气管肺炎变化,免疫组织化学检测病毒抗原也为阴性。对照猕猴同源或异源病毒攻击后第3天呼吸系统不同部位组织均分离到高滴度复制病毒,组织病理学发现有中度或严重的支气管肺炎变化,免疫组织化学检测到肺脏存在大量病毒抗原;攻击后第14天,BHG/05感染对照猕猴呼吸系统不同部位组织已检测不到复制病毒,但AH/05感染对照猕猴喉头扁桃体组织仍可检测到高滴度病毒复制。本研究利用反向遗传操作技术成功构建了H5N1亚型禽流感病毒冷适应弱毒疫苗候选株。经实验证实,该疫苗株具有预期的ca和ts特性,具有良好的生物安全性,并在BALB/c小鼠上显示出良好的免疫原性和保护效力。灵长动物模型免疫及攻毒保护试验显示,H5N1禽流感病毒冷适应弱毒疫苗候选株可有效诱导保护性抗体反应,对抗原基因同源及异源高致病力禽流感病毒攻击,不仅具有临床保护效力,而且能够完全阻断攻击病毒在体内的复制。本研究显示,冷适应弱毒疫苗是非常有希望的人类H5N1禽流感大流行候选疫苗储备,同时为下一步的人类临床试验奠定了重要基础。H5N1亚型禽流感病毒已经引起300多人感染及超过50%的死亡率,但有关其跨宿主感染的分子遗传与分子致病机制仍然未能得到阐明。A/duck/Fujian/01/02（简称DKFJ/01）和A/duck/Guangxi/53/02（简称DKGX/53）为两株同一基因型的H5N1禽流感病毒,均具有良好的鸡胚生长特性,对鸡都呈高致病性,但对哺乳动物模型BALB/c小鼠的致病力却明显不同。其中DKGX/53病毒对小鼠呈低致病性（MLD50为106.4EID50）,只能在小鼠的肺脏中复制;而DKFJ/01对小鼠呈高致病性（MLD50为100.9EID50）,并呈全身复制。为了探索这两株病毒对小鼠致病性差异的分子机制,利用反向遗传操作技术,首先用DKGX/53的8个基因节段逐一替换DKFJ/01株相应基因,救获了8株高致病力背景的重组病毒,小鼠感染试验表明,DKGX/53株的聚合酶基因和M基因均能致弱DKFJ/01株对小鼠的致病力,其中聚合酶基因能使DKFJ/01株致病力减弱100倍,而其M基因却能使DKFJ/01株致病力减弱1000倍以上;同时,用DKFJ/01株8个基因节段逐一替换DKGX/53株相应基因,救获了8株低致病力背景的重组病毒,小鼠感染试验表明,只有DKFJ/01株的M基因可以增强DKGX株的致病力,并使其致病力增强1000倍以上,其他7个基因不能改变DKGX/53株对小鼠低致病力的生物学特性。DKGX/53和DKFJ/01之间M基因共有5个氨基酸的差异。为明确M基因中对致病力改变产生影响的关键氨基酸位点,分别以DKGX/53及DKFJ/01为背景,拯救了一系列异源片段嵌合M基因和定点突变M基因的重组病毒株。小鼠感染试验表明,N30D和T215A的单个突变分别能够轻度改变DKGX/53和DKFJ/01株的致病力,N30D和T215A的双突变可使其DKGX/53致病力增强1000倍以上;D30N和A215T的双突变可使DKFJ/01致病力减弱近10000倍。除DKGX/53外,M基因的D30和A215在目前已知的所有其它H5N1禽流感病毒具有高度保守性。为进一步探索DKGX/53病毒株M基因的30N和215T突变是否能致弱其他H5N1高致病性禽流感病毒,利用反向遗传操作技术,对2株H5N1高致病性禽流感病毒DKGX/35（MLD50<101.8EID50）和DKGX/27（MLD50<100.6EID50）的M基因进行D30N和A215T双突变。结果表明,突变后DKGX/35对小鼠致病力致弱10000倍以上,DKGX/27对小鼠致病力致弱1000倍以上。本研究系统证明,M基因对H5N1高致病力禽流感病毒感染哺乳动物致病力方面发挥重要作用,M基因的N30D和T215A突变可显著改变H5N1禽流感病毒对哺乳动物的致病力。研究结果为新型弱毒疫苗及抗病毒药物的研究提供了新的基因修饰与结构靶点。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 高致病性禽流感病毒的流行现状

1.2 H5N1 亚型禽流感病毒的抗病毒药物

1.3 人禽流感病毒疫苗的发展现状

1.3.1 灭活全病毒疫苗

1.3.2 弱毒活疫苗

1.3.3 腺病毒载体疫苗

1.3.4 4 质粒反向遗传操作技术对疫苗生产的改进

1.3.5 生产流感疫苗的其他策略

1.3.6 研制有效流感疫苗株的未来发展方向

1.4 流感病毒的宿主特异性

1.5 流感病毒致病性的分子基础

1.5.1 血凝素蛋白与其致病性的关系

1.5.2 NA 蛋白与流感病毒致病性的关系

1.5.3 聚合酶复合体与流感病毒的致病性关系

1.5.4 核蛋白与流感病毒致病性的关系

1.5.5 基质蛋白与禽流感病毒致病性的关系

1.5.6 离子通道蛋白与流感病毒致病性的关系

1.5.7 NS1 非结构蛋白与流感病毒致病性的关系

1.5.8 NS2 结构蛋白与流感病毒致病性的关系

1.6 A 型流感病毒的反向遗传技术的发展史

1.7 本研究的目的和意义

第二章 H5N1 亚型禽流感病毒弱毒活疫苗株的构建及其生物学特性研究

2.1 材料

2.1.1 病毒株

2.1.2 SPF 鸡胚及细胞

2.1.3 pBD 载体

2.1.4 质粒

2.1.5 主要试剂

2.1.6 引物

2.1.7 内部基因组 DNA 的合成

2.2 方法

2.2.1 疫苗株内部基因 DNA 序列的合成及鉴定

2.2.2 重组pBD 转染质粒的构建

2.2.3 H5N1 亚型重配病毒的拯救

2.2.4 救获的2 株重配病毒的序列鉴定

2.2.5 救获的2 株重配病毒的温度敏感性（temperature sensitive）测定

2.2.6 救获的2 株重配病毒的冷适应性（cold-adapted）测定

2.3 结果

2.3.1 合成 DNA 序列鉴定结果

2.3.2 重组pBD 阳性质粒的鉴定结果

2.3.3 救获重配病毒的 PCR 鉴定结果

2.3.4 救获重配病毒和野生病毒的温度敏感性测定

2.3.5 救获的重配病毒和野生病毒的冷适应性测定结果

2.4 讨论

第三章救获的重配病毒在 SPF 鸡和哺乳动物模型BALB/C 小鼠上的生物安全评价

3.1 材料与方法

3.1.1 病毒

3.1.2 SPF 鸡胚及试验动物

50)的测定'>3.1.3 鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定

3.1.4 SPF 鸡鼻腔感染试验及排毒检测试验

3.1.5 静脉接种指数测定（IVPI）

3.1.6 BALB/c 小鼠的致病性试验

3.1.7 小鼠脏器病毒分离滴定

3.2 结果

50)测定结果'>3.2.1 鸡胚半数感染量(EID₅₀)测定结果

3.2.2 重配病毒对鸡的致病性试验结果

3.2.3 重配病毒和野生病毒对 BALB/c小鼠的致病性试验结果

3.2.4 救获的重配病毒与野生病毒在小鼠体内的复制

3.3 讨论

3.3.1 救获的重配病毒对鸡的致病性减弱

3.3.2 重配病毒对哺乳动物模型 BALB/c小鼠的致病性减弱

第四章 H5N1 亚型弱毒活疫苗株在哺乳动物模型 BALB/C小鼠上免疫原性和免疫效力评价

4.1 材料与方法

4.1.1 病毒

4.1.2 实验动物

4.1.3 BALB/c 小鼠的免疫试验

4.1.4 血凝抑制抗体的测定试验

4.1.5 中和抗体测定试验

50)'>4.1.6 小鼠半数致死量测定(MLD₅₀)

4.1.7 攻毒保护试验

4.2 结果

50 测定结果'>4.2.1 3 株野生病毒的 TCID₅₀测定结果

50 的测定结果'>4.2.2 3 株野生病毒的 MLD₅₀的测定结果

4.2.3 单剂量免疫后 HI 抗体的测定结果

4.2.4 单剂量免疫后中和抗体的测定结果

4.2.5 加强免疫后 HI 抗体的测定结果

4.2.6 加强免疫后中和抗体的测定结果

4.2.7 单剂量免疫的小鼠用同源病毒攻击后的体重变化和死亡结果

4.2.8 单剂量免疫的小鼠用同源病毒攻击后的脏器滴定结果

4.2.9 单剂量免疫的小鼠用异源病毒攻击后的体重变化和死亡结果

4.2.10 单剂量免疫的小鼠用异源病毒的攻击后的脏器滴定结果

4.2.11 加强免疫组用同源病毒攻击后的死亡结果和脏器滴定结果

4.2.12 加强免疫组用异源病毒攻击后的死亡结果和脏器滴定结果

4.3 讨论

第五章 H5N1 亚型弱毒活疫苗株在灵长类动物模型猕猴上免疫效力评价与攻毒保护试验

5.1 材料与方法

5.1.1 病毒

5.1.2 实验动物

5.1.3 主要试剂和仪器

5.1.4 免疫试验

5.1.5 猴血清非特异性抑制素的去除

5.1.6 ELISA 抗体检测

5.1.7 中和抗体（NT）的检测

5.1.8 血凝抑制抗体（HI）的检测

5.1.9 攻毒实验

5.1.10 采集脏器的病毒滴定

5.2 结果

5.2.1 免疫后猕猴的精神状态观察结果

5.2.2 免疫后猕猴的鼻腔排毒情况

5.2.3 ELISA 抗体检测结果

5.2.4 HI 抗体检测结果

5.2.5 中和抗体检测结果

5.2.6 攻毒后猕猴的精神状态、食欲及体温变化

5.2.7 攻毒后猕猴的排毒情况

5.2.8 攻毒后1 周和2 周的 ELISA 抗体、NT 抗体和 HI 抗体滴度变化

5.2.9 攻毒后3 天组织脏器病毒滴定结果和病理检测结果

5.2.10 攻毒后15 天的病毒分离结果

5.3 讨论

第六章 H5N1 亚型禽流感病毒对哺乳动物模型 BALB/C小鼠致病性差异的分子机制研究

6.1 材料与方法

6.1.1 毒株与试验动物

6.1.2 pBD 载体

6.1.3 主要试剂

6.1.4 引物

6.1.5 病毒 RNA 提取、反转录、PCR 及序列测定

6.1.6 重组质粒的构建

6.1.7 病毒拯救与救获重组病毒的鉴定

50)的测定'>6.1.8 救获病毒鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定

6.1.9 救获的重组病毒和野生病毒对 BALB/c 小鼠的致病性试验

6.1.10 组织脏器病毒分离滴定

6.1.11 嵌合病毒拯救及鉴定

6.1.12 M 基因点突变病毒的救获

50 的测定'>6.1.13 嵌合病毒及突变病毒 EID₅₀的测定

6.1.14 嵌合病毒和点突变病毒的致病性试验

6.1.15 氨基酸保守性的分析

6.1.16 DKGX/35 和 DKGX/27高致病力病毒M基因的双突变引物

6.1.17 拯救在 DKGX/35 和 DKGX/27 高致病力病毒背景下M基因的双突变病毒

50的测定'>6.1.18 突变病毒 EID₅₀的测定

6.1.19 2株突变病毒 DKGX/35-M1D30N/A215T 和DKGX/27-M1D30N/A215T 对小鼠的致病性试验

6.2 结果

6.2.1 病毒筛选

6.2.2 重组pBD 阳性质粒鉴定结果

6.2.3 重组病毒救获与鉴定结果

50)的测定结果'>6.2.4 救获病毒鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定结果

6.2.5 野生病毒和救获亲本病毒对小鼠的致病性试验试验结果

6.2.6 单基因替换重组病毒对小鼠的致病性试验结果

50/mL)'>6.2.7 嵌合病毒与突变病毒的鸡胚半数感染量的测定(EID₅₀/mL)

6.2.8 嵌合病毒对小鼠的致病性试验结果

6.2.9 点突变病毒对小鼠的致病性试验结果

6.2.10 DKGX/53 和 DKFJ/01 病毒M基因的30、215位氨基酸的保守性分析

6.2.11 拯救在高致病力病毒 DKGX/35 和 DKGX/27背景下的M基因双突变病毒

6.2.12 突变病毒对小鼠的致病性试验

6.3 讨论

第七章全文结论

参考文献

致谢

个人简历

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