红花浸液对白血病抑制因子在小鼠早孕子宫内膜表达影响的研究

论文摘要

胚胎植入是胚胎和子宫内膜之间相互作用、相互识别的过程，关键在于胚胎和子宫内膜发育的同步性，这一过程受多种因素的精确调节，除雌、孕激素外，子宫内膜细胞分泌多种细胞因子，如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor-2，IGF-2）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、集落刺激因子-1（colony-stimulating factor，CSF）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）等，影响母胎的生理状态和胚胎植入的局部环境，以此保证胚泡和子宫内膜发育的同步性，使两者彼此相融发生着床。阅读文献可知，LIF是一种多功能细胞因子，在子宫内膜，LIF细胞因子是胚胎着床的必要条件，在植入过程中起关键性的作用，缺乏LIF的胚胎不能发生植入或者发生流产事件。Bhatt H等的研究表明：LIF在小鼠子宫内膜腺上皮的表达最高，尤其是在孕4天。张松灵等曾报道，在小鼠子宫内，采用原位杂交及免疫组化分析法观察到：LIF mRNA及LIF蛋白定位于子宫内膜腺上皮及子宫内膜腔上皮，分别在发情期及胚泡着床前的阶段出现两个峰值表达；在人类，免疫染色法检测到LIF在子宫内膜腔上皮中表达最高，其次是腺上皮，基质中最低；LIF表达的减少或缺失可能导致不孕。红花具有活血通经、祛瘀止痛的功效，临床上常用来治疗痛经、闭经等妇科疾病。红花煎剂对小鼠、豚鼠等的连体及离体子宫均表现有明显的兴奋作用；小剂量水煎剂可使子宫发生紧张性或节律性收缩，大剂量可使子宫紧张性与兴奋性提高，甚至达到痉挛的程度，此现象对受孕者更为明显。课题组曾以红花为主方进行抗早孕的实验研究，结果表明：红花组与对照组的卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、雌激素（estrogen2，E2）和孕激素（progestogen，P）等无浓度差异，表明红花的抗早孕作用并非是通过垂体—卵巢轴激素的影响来实现的。红花抗早孕的作用机制目前尚不清楚。因此，本研究以孕2天小鼠为研究对象，灌服不同剂量的红花浸液和等量生理盐水后，观察用药后小鼠生育抑制和停药后生育恢复情况，进一步探讨红花浸液对小鼠生育情况的影响；观察孕鼠子宫内膜的形态学改变、子宫内膜细胞LIF蛋白和LIF mRNA表达的改变，并探讨其作用机制。结果表明，红花浸液可通过抑制孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白和LIF mRNA的表达而起到抗早孕的作用，其抗早孕的作用是可逆的。这一研究结果为进一步研究红花抗早孕的作用机制以及将来中药红花的临床应用提供重要的参考和理论依据。全文摘要如下：红花浸液对小鼠生育的抑制及停药后生育恢复情况的研究以成年未经产雌性昆明小鼠40只为研究对象，雌雄鼠1：1合笼交配，第二天清晨查到阴栓定为孕1天，随机将孕鼠分为4组，每组10只：其中一组灌服等量的生理盐水，作为正常对照组；另外三组分别灌服10.5 g／kg、15.5 g／kg、20.5 g／kg红花浸液，作为实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。分别于孕第2、3、4天早上8：00灌服不同剂量的红花浸液和等量生理盐水，观察红花浸液对孕鼠的生育抑制和停药后生育恢复情况。实验结果如下：（1）给药后，各实验组小鼠生育情况有不同程度的抑制，且药物剂量越高，生育抑制情况越明显，实验Ⅰ组5只小鼠生育被抑制，实验Ⅱ组8只小鼠生育被抑制，实验Ⅲ组10只小鼠生育全部被抑制；对照组小鼠生育均不受影响。（2）停药后，各实验组小鼠逐渐恢复生育能力，且药物剂量越高，生育恢复时间越晚，实验Ⅰ组小鼠喂药后第6天全部恢复生育，实验Ⅱ组小鼠喂药后第8天9只恢复生育，实验Ⅲ组小鼠停药后第10天9只恢复生育；而对照组小鼠生育恢复均不受影响。以上结果提示：红花浸液具有抗早孕的生物学效应，其抗早孕的作用是可逆的，停药后生育能力可完全恢复；孕鼠的生育抑制情况和停药后生育恢复情况有明显的药物剂量依赖性。红花浸液对孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白和LIF mRNA表达影响的研究成年未经产雌性昆明小鼠24只，雌雄鼠1：1合笼交配，第二天清晨查到阴栓定为孕1天，随机将孕鼠分为4组，每组6只：其中一组灌服等量的生理盐水，作为正常对照组；另外三组分别灌服10.5 g／kg、15.5 g／kg、20.5 g／kg红花浸液，作为实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。分别于孕第2、3、4天早上8：00灌服不同剂量的红花浸液和等量生理盐水，孕鼠停药后24 h颈椎脱臼处死小鼠，取双侧子宫，石蜡包埋连续制片，烤干后进行如下处理：（1）HE染色观察各实验组和对照组孕鼠子宫内膜的形态改变；（2）免疫组化染色观察各组孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白的表达；（3）原位杂交染色观察各组孕鼠子宫内膜细胞LIF mRNA的表达。根据以上形态和检测指标综合分析红花浸液对孕期子宫内膜形态和LIF表达的影响。实验结果如下：（1）HE染色显示：实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组孕鼠灌服不同剂量的红花浸液后，孕鼠子宫内膜逐渐发生形态学改变：子宫内膜充血，上皮细胞排列紊乱；药物剂量越高，子宫内膜的形态学改变越明显；对照组孕鼠子宫内膜形态未见明显的改变。（2）免疫组化染色检测LIF蛋白的表达：图像分析结果显示，对照组孕鼠子宫内膜LIF蛋白呈强阳性表达，其平均光密度为0.3 702 201±0.0 390 275，可见子宫内膜腺体和游离面上皮的细胞浆内都有表达：实验组Ⅰ孕鼠子宫内膜LIF蛋白呈现阳性表达，其平均光密度为0.3 368 947±0.0 421 678；实验组Ⅱ孕鼠LIF蛋白呈弱阳性表达，其平均光密度为0.2 498 949±0.0 466 385；实验组Ⅲ孕鼠子宫内膜LIF蛋白阴性表达，其平均光密度为0.1 738 566±0.0 081749。各实验组LIF蛋白阳性部位平均光密度值均显著低于对照组（P＜0.05，P＜0.01），而且呈现随红花用药剂量递增而逐渐下降的趋势，各实验组之间均存在显著性差异（P＜0.01）。（3）原位杂交染色检测LIF mRNA的表达：图像分析结果显示，对照组孕鼠子宫内膜LIF mRNA呈强阳性表达，其平均光密度为0.4 476 607±0.0 449072，主要表达于腺上皮细胞的胞浆内，部分内膜基质细胞的胞浆内也有表达，但腔上皮细胞的胞浆内未见到阳性着色；实验组Ⅰ孕鼠子宫内膜LIF mRNA呈现阳性表达，其平均光密度为0.3 549 777±0.0 263 848；实验组Ⅱ孕鼠LIFmRNA呈弱阳性表达，其平均光密度为0.2 640 995±0.0 213 754。各实验组LIF mRNA阳性部位平均光密度值均显著低于对照组（P＜0.01），而且呈现随红花用药剂量递增而逐渐下降的趋势，各实验组之间均存在显著性差异（P＜0.01）。以上结果提示：红花浸液可使孕鼠子宫内膜发生形态学改变，造成胚胎和子宫内膜发育的不同步性，从而影响了胚胎着床时子宫内膜的微环境，造成胚胎不能着床；红花浸液可能通过抑制孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白的表达而发挥抗早孕的作用；孕鼠子宫内膜细胞LIF蛋白表达的减少与LIF mRNA表达的减少有关系，LIF蛋白与LIF mRNA的表达与红花浸液间也有明显的剂量依赖关系。总之，本文主要通过一系列对LIF蛋白和LIF mRNA基因水平上的研究，进一步揭示红花抗早孕的作用机理，为将来中药红花的临床应用提供重要的参考和理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 主要试剂
• 主要仪器设备
• 主要试剂配置
• 正文
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 文献综述
• 正文
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文、参与的科研课题
• 学位论文评阅及答辩情况表