NOD蛋白在烟曲霉感染小鼠肺组织中的表达及对烟曲霉孢子的识别机制

论文摘要

烟曲霉（Af）是目前最常见的空气传播的真菌感染病原体，可导致免疫受损患者发生严重且往往是致死性的侵袭性肺曲霉病（IPA）。随着免疫受损患者的增多，IPA发病率显著增加，已成为目前免疫受损患者最常见的肺部感染性疾病之一。在过去的十余年中，尽管不断有新的抗真菌药物问世，但由于IPA早期诊断困难且病情进展迅速，其病死率仍居高不下。故开展机体抵御烟曲霉感染的免疫反应机制研究，探索预防和治疗烟曲霉感染的新措施，对于降低IPA发病率和病死率具有十分重要的意义。先天性免疫系统是机体识别、抵御病原体感染的第一道防线，它通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）来迅速识别病原体。目前研究最多的PRRs为Toll样受体（toll-like receptors，TLRs），已被证实与抗烟曲霉感染免疫反应有关。另一类PRRs是近年来才发现的核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide- binding oligomerization domain，NOD）蛋白。NOD蛋白为胞浆内蛋白，目前认为它们与识别细胞内病原体有关。已知的NOD蛋白家族成员有20余种，其中最为重要的是NOD1和NOD2。NOD1又称CARD（caspase recruitment domain）-4蛋白，在全身各种组织细胞中都有分布，识别主要存在于革兰阴性菌中的肽聚糖（PGN）的降解产物GM-triDAP。NOD2又称CARD15，分布主要局限于上皮细胞和抗原呈递细胞（APCs），识别的最小基序为胞壁酰二肽（MDP）。MDP同时存在于革兰阴性和阳性细菌胞壁PGN的降解产物中。尽管NOD1和NOD2识别的配体不同，但它们都是通过受体相互作用蛋白2（receptor-interacting protein 2，RIP2）来激活NF-κB信号通路，促进一系列细胞因子的合成。已经证实NOD蛋白与多种细菌感染免疫反应有关。烟曲霉孢子通过空气传播，由于其体积小，可顺利进入下呼吸道，当条件适宜生长时便出芽形成菌丝，侵袭组织细胞，造成组织损伤。肺上皮细胞及肺泡巨噬细胞作为肺部先天性免疫的主要组成细胞，能够吞噬、杀灭烟曲霉孢子，释放出一系列炎症细胞因子，在抵御烟曲霉感染中发挥重要作用。已有研究表明PRRs在先天性免疫系统占有重要地位，但迄今为止NOD蛋白在肺组织中的表达仅有少量研究报道，尚未见NOD蛋白在抗烟曲霉感染免疫反应中作用的研究报道。鉴于烟曲霉系胞内感染病原体，我们假设NOD蛋白可能为烟曲霉的胞浆内PRRs。本研究通过建立烟曲霉肺部感染小鼠模型及A549、THP1细胞的培养来研究肺组织中NOD相关蛋白的表达及对烟曲霉孢子的识别机制。第一部分NOD相关蛋白在烟曲霉感染小鼠肺组织中的表达目的：观察NOD相关蛋白在烟曲霉感染小鼠肺部组织中的表达。方法：60只雄性BALB／c小鼠随机分成2组，每组30只。通过经鼻滴入烟曲霉孢子的方法建立烟曲霉肺部感染小鼠模型，对照组小鼠经鼻滴入等量的生理盐水。分别在感染前（0h）、感染后6h、12h、24h、48h观察肺部烟曲霉负荷及病理学改变。采用RT-PCR方法检测各时间点的NOD1、NOD2及RIP2 mRNA在肺组织中的表达。采用免疫组化的方法检测各时间点两组小鼠肺组织NOD2蛋白的表达。结果：（1）感染组小鼠肺部烟曲霉负荷24h达最高峰，48h迅速下降。（2）两组小鼠肺组织均表现为支气管肺泡炎症为主的病理改变。感染组小鼠24h炎症反应最显著，48h减轻。对照组小鼠病理损害明显轻于感染组。（3）接种烟曲霉前（0h）、后6h、12h、24h、48h NOD1 mRNA表达量分别为0.34±0.05、0.41±0.08、0.46±0.07、0.47±0.04、0.47±0.48；NOD2 mRNA表达量分别为0.30±0.03、0.36±0.06、0.45±0.10、0.60±0.06、0.73±0.08；RIP2 mRNA表达量分别为0.44±0.10、0.56±0.09、0.62±0.07、0.64±0.07、0.63±0.06。感染后12h、24h、48h NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表达上调，同感染前（0h）相比有显著差异（P＜0.05）。NOD2 mRNA的表达上调比NOD1更加明显。对照组各时间点NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表达无显著差异。感染组和对照组比较除0h、6h外各时间点NOD1、RIP2 mRNA表达均有显著差异（P＜0.05）。除0h外两组各时间点NOD2 mRNA表达有显著差异（P＜0.05）。（4）NOD2蛋白表达主要分布在肺泡上皮细胞。感染组小鼠肺组织0h、12h、24h、48h时NOD2蛋白免疫组化阳性指数分别为117582.7±20189.58、163854.4±17185.61、341363.9±35102.07、289114.5±38424.35，24h NOD2蛋白表达同0h相比差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组各时间点NOD2蛋白表达无显著差异。感染组、对照组组间比较24h、48h NOD2蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：烟曲霉肺部感染后肺组织中NOD相关蛋白（尤其是NOD2）表达增加，提示NOD相关蛋白尤其是NOD2与烟曲霉肺部感染有关，可能参与了抗烟曲霉肺部感染的免疫反应。第二部分A549、THP1细胞中NOD2蛋白的表达与烟曲霉孢子刺激及TNF-α分泌的相关性研究目的：观察灭活烟曲霉孢子刺激人肺泡上皮细胞株A549及人单核／吞噬细胞株THP1后细胞中NOD2蛋白和NOD2蛋白的下游物RIP2激酶的表达，以及MDP对Af孢子刺激上述细胞分泌TNF-α的影响，探讨NOD2蛋白在机体抗烟曲霉感染免疫反应中的作用。方法：（1）透射电镜观察A549、THP1细胞与烟曲霉孢子孵育10h、24h、48h后细胞及胞浆内孢子的形态。（2）Real-time PCR检测A549、THP1细胞在烟曲霉孢子刺激前（0h）、后24h、48h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表达。（3）Real-time PCR检测不同刺激强度的烟曲霉孢子刺激A549、THP1细胞后NOD2 mRNA表达。（4）免疫荧光法观察烟曲霉孢子刺激A549细胞后NOD2蛋白的表达。（5）采用免疫沉降后western blot的方法检测不同刺激强度的烟曲霉孢子刺激A549、THP1细胞后NOD2蛋白的表达。（6）ELISA法检测烟曲霉孢子单独和联合NOD2的特异性配体MDP刺激A549、THP1细胞后TNF-α的分泌。结果：（1）烟曲霉孢子与A549、THP1孵育10h后胞浆内即可见到吞噬的孢子，24h时溶酶体内可见到部分消化状态的烟曲霉孢子。（2）A549、THP1细胞在烟曲霉孢子刺激后24h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表达明显上调，与0h比较差异有统计学意义（P＜0.05）。48h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表达均减少。（3）烟曲霉孢子刺激A549、THP1细胞后NOD2 mRNA表达水平随刺激强度的增加而上调，各组间表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）免疫荧光法可见烟曲霉孢子刺激后NOD2蛋白表达增加。（5）烟曲霉孢子刺激A549、THP1细胞后NOD2蛋白的表达增加，不同刺激强度组间差异有统计学意义（P＜0.05）。（6）空白对照组、MDP单独刺激、烟曲霉孢子单独刺激、烟曲霉孢子联合MDP刺激组4组A549细胞培养液中TNF-α含量分别为10.46±0.70、11.36±1.20、12.63±2.76、13.94±3.42 pg／ml；4组THP1细胞培养液中TNF-α含量分别为27.40±5.72、27.93±9.11、32.63±4.71、82.13±10.76 pg／ml。MDP能够显著增加烟曲霉孢子刺激后细胞TNF-α的分泌（P＜0.05）。结论：NOD2蛋白的表达与烟曲霉孢子的吞噬和消化密切相关，并在促进TNF-α分泌方面发挥一定作用。其作用可能是作为PRRs识别烟曲霉孢子的降解产物，并通过RIP2激酶激活下游信号通路，促进TNF-α分泌。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 附录
• 致谢