微胶囊固定化细胞生物合成胞苷三磷酸

论文摘要

胞苷三磷酸（CTP）作为一种重要的核苷酸类药物和医药中间体,其价格昂贵限制了其在临床上的应用。为了降低生产成本,简化工艺并提高其产量和纯度,本文以胞苷一磷酸（CMP）为底物,研究了利用游离啤酒酵母和海藻酸钠（SA）-纤维素硫酸钠（NaCS）/聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDMDAAC）微胶囊固定化酵母生物法合成CTP,旨在提高了转化率和CTP产量。首先,利用NaCS和SA构建双组分聚阴离子体系,再与聚阳离子PDMDAAC制备用于细胞固定化的微胶囊。以脱脂棉作为纤维素制备NaCS,通过研究浓硫酸和正丙醇体积比、反应时间、固液比、温度等对NaCS得率及粘度的影响,得到制备NaCS最优化条件为:浓硫酸和正丙醇体积比为1:1,反应时间60 min,固液比1:20,反应温度2℃C,得到的NaCS的取代度为0.38,运动粘度为38 mPa·s,得率为90%。随后,为了考察微胶囊的直径、机械强度和囊膜厚度,研究了聚阴离子和聚阳离子浓度、反应时间等因素并确定了形成微胶囊的最佳条件:SA 1%、NaCS 4%、PDMDAAC 5%,常温下反应40 min。然后研究小分子物质（无机磷,葡萄糖和CMP）透过胶囊的扩散特性,并且为了制备更适宜发酵生产的固定化酵母,研究了啤酒酵母与聚阴离子的质量体积比为0.3时较好,该条件下得到的固定化酵母与湿酵母的质量比大约为2.5:1。其次研究了游离酵母生物合成CTP,利用啤酒酵母将CMP转化为CTP,通过分离出酵母并将上清液静置的方法,提高了底物的转化率。结果表明,250 mL锥形瓶中加入20 mL反应液（CMP40mmol/L,葡萄糖150 mmol/L,磷酸缓冲液150 mmol/L,氯化镁10 mmol/L,pH6.5）,啤酒酵母15g,35℃下反应3h,分离出酵母,并将上清液放置7 h,转化率可达85%。最后研究了利用微胶囊固定化酵母细胞将CMP转化为CTP,通过分批补料添加葡萄糖提高了转化率。结果表明,250 mL锥形瓶中加入20mL反应液（CMP 60 mmol/L,葡萄糖150 mmol/L,磷酸缓冲液250mmol/L,氯化镁20mmol/L,pH7）,固定化酵母25g,在35℃下反应/2h添加葡萄糖0.27 g/次,添加2次后,即总反应时间为6 h,转化率可达80%以上。该固定化酵母细胞可以反复利用5次以上,且转化率稳定在70%左右。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 绪论
• 1.1 胞苷三磷酸
• 1.1.1 胞苷三磷酸的理化性质
• 1.1.2 胞苷三磷酸的生物学功能及应用
• 1.1.3 胞苷三磷酸的合成研究进展
• 1.2 生物微胶囊技术
• 1.2.1 生物微胶囊的制备
• 1.2.2 生物微胶囊的性能
• 1.2.3 纤维素硫酸钠及NaCS-PDMDAAC微胶囊
• 1.3 本文的研究思路和目标
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 葡萄糖的测定
• 2.3.2 无机磷的测定
• 2.3.3 核苷酸分析方法的建立
• 2.3.4 SA/NaCS-PDMDAAC微胶囊性能研究
• 第三章 SA/NaCS-PDMDAAC微胶囊的制备和研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 NaCS的制备实验流程
• 3.2.2 SA/NaCS-PDMDAAC微胶囊的制备
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 NaCS的制备因素影响
• 3.3.2 SA/NaCS-PDMDAAC微胶囊的制备因素影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 游离酵母生物合成胞苷三磷酸合成的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 单因素水平优化实验
• 4.3.2 正交优化实验
• 4.3.3 啤酒酵母催化合成CTP
• 4.4 本章小结
• 第五章 SA/NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化酵母生物合成胞普三磷酸
• 5.1 引言
• 5.2 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 单因素水平优化实验
• 5.3.2 正交优化实验
• 5.3.3 固定化细胞的反应批次研究
• 5.4 本章小结
• 第六章 总结和展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 缩略语一览表
• 致谢
• 在读期间发表论文