论文摘要
第一章人视网膜色素上皮细胞表达及分泌转化生长因子β2的水平目的:体外培养人视网膜色素上皮（retina pigment epithelium,RPE）细胞系D407,观察正常培养条件下其表达及分泌转化生长因子β2（transforming growth factorβ2,TGF-β2）的水平。方法:取生长状态良好的人RPE细胞系D407,于含有10%小牛血清的DMEM培养液中常规培养（37℃,5%CO2）,收集换液后2,4,8,16,24和48小时的培养上清液及细胞,用细胞免疫化学法确定TGF-β2蛋白质的表达定位,RT-PCR及Western-blot法检测细胞中TGF-β2mRNA和蛋白质的表达水平,ELISA法检测上清液中TGF-β2蛋白质的含量。统计学方法采用单因素方差分析。结果:D407细胞TGF-β2蛋白质的表达定位于细胞浆;细胞中TGF-β2mRNA和蛋白质的表达水平各时间点比较无统计学意义（P＞0.05）;上清液中TGF-β2含量于培养4小时后开始上升,24小时达最大值,为586.9±28.5pg╱mL,各时间点比较有统计学意义（F=86.593,P＜0.001）。结论:人RPE细胞TGF-β2蛋白质的表达定位于细胞浆,RPE细胞可恒定表达并分泌TGF-β2。第二章卡巴胆碱和阿托品对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响目的:观察不同浓度的卡巴胆碱和阿托品作用下D407细胞形态学及增殖率的变化,确定两种药物适用于人RPE细胞功能学研究的浓度范围。方法:取生长状态良好的D407细胞,于含有10%小牛血清的DMEM培养液中常规培养（37℃,5%CO2）,按5×103/孔的密度接种于96孔板,贴壁后予无血清培养基孵育24小时达到同步化,将细胞分为3组:（1）卡巴胆碱组(A1～6组):A1～A6组依次加入10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L和10-3mol/L卡巴胆碱;（2）阿托品组(B1～6组):B1～B6组依次加入10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L和10-3mol/L阿托品:（3）对照组（C组）:不加药物,用无血清培养基常规培养。观察72小时,每24小时相差显微镜下观察细胞形态,行MTT法了解细胞增殖情况。统计学方法采用重复测量设计资料的方差分析。结果:不同浓度卡巴胆碱对D407细胞形态无明显影响,对细胞增殖有促进作用。A值随时间延长逐渐升高,各时间点比较差异有统计学意义（F=3200.150;P＜0.001）;各组间比较差异有统计学意义（F=3.324;P＜0.05）。LSD法显示,各时间点两两比较差异均有统计学意义（P＜0.001）;A6组(卡巴胆碱浓度10-3mol/L)与其他各组两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,其余各组间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。卡巴胆碱浓度与作用时间之间无交互作用（F=0.307;P＞0.05）。10-3mol/L阿托品作用24小时后D407细胞出现明显皱缩、变圆,轮廓增强,胞浆内出现中毒颗粒,细胞增殖程度显著下降;48小时和72小时后部分细胞恢复正常形态,但仍可见皱缩细胞。10-8mol/L～10-4mol/L阿托品作用下D407细胞形态无明显变化。A值随时间延长逐渐升高,各时间点比较差异有统计学意义（F=6999.917;P＜0.001）;各组间比较差异有统计学意义（F=25.726;P＜0.001）,LSD法显示,各时间点两两比较差异均有统计学意义（P＜0.001）;B6组(阿托品浓度10-3mol/L)与其他各组两两比较差异均有统计学意义（P＜0.001）,其余各组间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。阿托品浓度与作用时间之间存在交互作用（F=2.708;P＜0.01）。结论:卡巴胆碱浓度为10-3mol/L时促进RPE细胞增殖的效应显著;阿托品浓度为10-3mol/L时可明显抑制RPE细胞增殖;卡巴胆碱和阿托品浓度在10-8mol/L～10-4mol/L范围内对人RPE细胞形态及增殖无显著影响,可用于研究其对RPE细胞功能的调控。第三章卡巴胆碱对人视网膜色素上皮细胞表达及分泌转化生长因子β2的调控目的:本实验通过观察卡巴胆碱干预下D407细胞表达及分泌TGF-β2的时效和量效关系,研究其对人RPE细胞表达及分泌TGF-β2的调控,旨在阐明胆碱能神经递质参与近视信号的级联传递。方法:利用含有10%小牛血清的DMEM培养基中常规培养D407细胞,药物干预前换用无血清培养基（SFM）培养24小时。分为:（1）实验组(A1～5组):A1～A5组依次加入10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L和10-4mol/L卡巴胆碱;（2）空白组:不加药物。分别于处理后2、4、8、16、24、48小时采用RT-PCR、Western blot、ELISA法检测细胞胞浆中TGF-β2mRNA及蛋白质的表达水平和上清液中TGF-β2的含量,分析时效与量效关系。统计学方法采用重复测量设计资料的方差分析。结果:D407细胞TGF-β2mRNA、蛋白质表达水平及上清液中TGF-β2蛋白质含量均随时间延长而逐渐升高,各时间点之间比较差异具有统计学意义（F=4455.148,2619.21,3280.75;P＜0.001）;LSD法两两比较每两组间差异均有统计学意义（P＜0.001）。TGF-β2mRNA、蛋白质表达水平及上清液中TGF-β2蛋白质含量随卡巴胆碱浓度升高亦逐渐升高,各组间比较差异具有统计学意义（F=1102.240,2918.62,448.45;P＜0.001）。LSD法两两比较发现,TGF-β2mRNA表达水平A1、A2、A3组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）,TGF-β2蛋白质表达水平A2、A3组及A4、A5组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）,细胞上清中TGF-β2蛋白质含量A3、A4、A5组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;其余各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.001）。卡巴胆碱浓度与干预时相之间存在交互作用（F=249.609,186.02,92.96;P＜0.001）。结论:卡巴胆碱可促进人RPE细胞TGF-β2的表达及分泌,效应具有时间和浓度依赖性;并且该效应随时间的变化趋势受卡巴胆碱浓度的影响。提示胆碱能神经递质可能通过促进RPE细胞表达及分泌近视相关信号分子的途径参与近视信号的逐级传递。第四章阿托品对人视网膜色素上皮细胞表达及分泌转化生长因子β2的调控目的:本研究通过观察不同浓度的阿托品联合10-5mol/L卡巴胆碱干预下D407细胞表达及分泌TGF-β2的变化,观察阿托品对RPE细胞表达及分泌TGF-β2的调控,旨在探寻阿托品延缓近视发展的可能机理及作用位点。方法:于含有10%小牛血清的DMEM培养基中常规培养D407细胞,药物干预前换用无血清培养基（SFM）培养24小时。分为:（1）实验组（A1～A5组）:依次加入10-4mol/L、10(-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L和10-8mol/L阿托品,孵育30分钟后每组加入10-5mol/L卡巴胆碱;（2）阳性对照组（B组）:加入10-5mol/L卡巴胆碱;（3）空白对照组（C组）:不加药物。于干预后24小时分别采用RT-PCR、Western blot、ELISA法检测细胞胞浆中TGF-β2mRNA及蛋白质的表达水平及上清液中TGF-β2的含量。统计学方法采用单因素方差分析。结果:D407细胞TGF-β2mRNA、蛋白质表达水平及上清中TGF-β2蛋白质含量不同干预组间比较差异具有统计学意义（F=1056.897,1320.170,475.657;P＜0.001）。LSD法两两比较显示,D407细胞TGF-β2mRNA表达水平A1组、C组及A5组、B组之间差异无统计学意义（P＞0.05）;蛋白质表达水平A1组、C组之间以及A3组、A4组之间差异无统计学意义（P＞0.05）;上清中TGF-β2蛋白质含量A1组、C组及A3组、A4组之间差异无统计学意义（P＞0.05）;其余各组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.001）。结论:M受体参与介导卡巴胆碱促进入RPE细胞表达及分泌TGF-β2的作用;阿托品可有效抑制卡巴胆碱促进入RPE细胞表达及分泌TGF-β2的功能。提示胆碱能M受体阻断剂可能通过此机制调控近视信号的逐级传递,从而阻断近视发展。
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