AMP激活的蛋白激酶在卤虫发育过程和应激条件下的分子特征和功能研究

论文摘要

AMP激活的蛋白激酶（AMPK）作为一种重要的能量感受因子对有机体从恶劣环境中存活至关重要。AMPK是个由三个亚基组成的异源三聚体,其中α亚基是催化亚基,β和γ是调节亚基。AMPK家族成员广泛存在于真核生物中,包括植物,酵母,线虫,昆虫,以及哺乳动物。迄今为止,甲壳类动物AMPK激酶的存在还未被报道。卤虫是一种原始的甲壳类动物,它能够产下休眠胚胎来应对恶劣的环境胁迫。这种包囊胚胎可以以极低的代谢率保持休眠状态多年,只有在环境适宜的情况下才会继续发育。但是,卤虫休眠和休眠后发育的内在调节机制现在还未研究清楚。作为一种重要的压力感受因子和能量调节因子,AMPK很可能跟卤虫应对外界刺激和选择繁殖方式有关。为了探索AMPK在卤虫生活史中的功能,我们从卤虫中分离了两种AMPKα亚基的cDNA分子。同时,我们对卤虫AMPKα基因在卤虫生活史中,以及卤虫在应激反应中的表达特征进行了分析。此外,利用特异性针对于磷酸化AMPK的抗体,我们对AMPK激酶在卤虫滞育后发育过程中的功能也进行了的研究。主要研究结果可以分为以下两部分:1.采用简并引物PCR方法,我们从卤虫中分离得到了两种AMPKα亚基的cDNA序列,分别命名为Afr-AMFKalpha1和Afr-AMPKalpha2。Afr-AMPKalpha1分子全长1858 bp,其开放阅读框长度为1548 bp,编码了515个氨基酸残基（命名为Afr-AMPKALPHA1）。此氨基酸序列具有基本的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。Afr-AMPKalpha2核酸序列与Afr-AMPKalpha1相比,在开放式阅读框长度少了244 bp,其他序列相同。因此,这个244 bp的缺失造成了移码突变,提早引入了一个终止密码子,使Afr-AMPKALPHA2蛋白的C末端变短。我们认为这两个cDNA可能来自于同一个基因的的选择性剪切。这两个蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域与其他物种AMPK的激酶域具有＞64%的相似性。此外,我们还采用半定量RT-PCR分析方法来检测AMPKα基因的表达情况。实验结果表明,Afr-AMPKalpha1基2.因在卤虫发育过程中以及应激反应中均呈现差异性表达。成虫的Afr-AMPKalpha1基因在热胁迫条件下表达减少,但是这种减少并不具有时间和温度依赖性。与此相反,休眠卵中Afr-AMPKalpha1基因的表达随热激时间的延长而减少。在高渗胁迫下,成虫中Afr-AMPKalpha1的表达量先是减少,然后随着胁迫时间的延长而增加。在饥饿条件下,成体的Afr-AMPKalpba1表达量随饥饿时间的延长而减少,直到第九天不能被检测到。而且,我们的结果还证明,在将产休眠卵的卤虫头部,Afr-AMPKalphs1的表达量急剧减少,这暗示着AMPK可能与卤虫的生殖方式改变有关。此外,Afr-AMPKalpha2分子的表达量太低,只能用巢式PCR检测到。Southern blotting表明卤虫的AMPK基因在基因组中可能以多拷贝形式存在。3.利用一个特异性结合磷酸化AMPK的抗体,本研究证明AMPK激酶在卤虫滞育后发育过程中特异性磷酸化。利用胚胎整体免疫组化技术,我们发现磷酸化的AMPK在早期的滞育后发育胚胎中主要成环状分布在外胚层部位,并且,随着发育的进行AMPK的磷酸化圈不断改变。另外,通过Western印记的方法,我们检测到磷酸化的AMPK与细胞核结合,而且这种结合不受细胞内pH值改变的影响。胚胎细胞核的免疫荧光染色实验也证明了这点。这些结果说明卤虫的AMPK激酶可能在发育继续后的基因表达调控上有作用。而且,我们用高效液相色谱法测定了胚胎内AMP,ADP,ATP的含量,结果表明卤虫AMPK的磷酸化不随AMP∶ATP的比值而变化。总之,我们在卤虫中克隆和鉴定了AMPKα基因从而首次证明了AMPK在甲壳类生物中的存在。此外,我们的研究结果暗示了AMPK激酶在卤虫应激和发育过程中,尤其是在滞育后发育的过程中起重要作用。本研究结果为更深入的探索AMPK功能和卤虫的发育生物学研究提供了宝贵的信息。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 摘要
• Abstract
• 缩写表
• 目次
• 第一部分 文献综述
• 1.AMPK激酶的研究概述
• 2.AMPK激酶的结构与活性调节
• 3.AMPK激酶在生物体内的功能
• 4.AMPK的上游激酶
• 5.AMPK的下游底物
• 6.LKB1-AMPK-TSC途径
• 7.展望
• 参考文献
• 第二部分 研究内容
• 第一章 AMPKα基因在卤虫中的分子克隆和表达特征分析
• 1.引言
• 2.材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3.方法
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 3'RACE cDNA的合成
• 3.3 卤虫AMPKα基因的分子克隆
• 3.4 Northern blotting分析
• 3.5 半定量RT-PCR
• 3.6 AMPKα基因组上拷贝数分析
• 4.结果
• 4.1 卤虫AMPKα基因的分子克隆与分子特征分析
• 4.2 Northern blotting结果
• 4.3 Afr-AMPKalphal在发育过程中的表达
• 4.4 Afr-AMPKa1pha1在应激情况下的表达
• 4.5 AMPKα基因组上的拷贝数分析
• 5.讨论
• 参考文献
• 第二章 卤虫AMPK的功能研究
• 1.引言
• 2.材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3.方法
• 3.1 总蛋白质的提取
• 3.2 Western blotting
• 3.3 胚胎整体免疫组化
• 3.4 细胞核和细胞质蛋白的分离
• 3.5 细胞核的抽提
• 3.6 细胞核的免疫荧光分析
• 3.7 细胞内ATP,AMP,和ATP的抽提
• 3.8 HPLC测定细胞内ATP,AMP和ATP含量
• 4.结果
• 4.1 AMPK在发育过程中的磷酸化研究
• 4.2 磷酸化的AMPK在发育过程中的组织定位
• 4.3 AMPK的在细胞内的定位
• 4.4 AMPK的磷酸化与AMP:ATP的关系研究
• 5.讨论
• 参考文献
• 第三章 结论与展望
• 1.结论
• 2.展望
• 第三部分 本研究的创新点
• 第四部分 附录
• 附录一 硕士阶段部分工作
• 附录二 常用试剂配制一览表
• 作者简历