盐藻（Dunalliela Salina）多糖的提取分离及结构研究

论文摘要

盐藻（Dunaliella salina）是一种生长于海水、咸水湖和盐湖等高盐环境下的单细胞绿藻,目前主要用于β-胡萝卜素的提取。除β-胡萝卜素外,盐藻中还含有丰富的多糖类化合物,具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物活性。本论文以去除了β-胡萝卜素的盐藻粉为原料,对其盐藻多糖的提取、分离纯化和结构分析进行了较为系统的研究。本论文通过四因素三水平正交试验确定了盐藻多糖的最适提取条件为:提取时间8 h,热水提取温度90℃,液固比20:1,pH10。在最适提取条件下提取得到多糖,经sevage法脱蛋白处理后得到盐藻多糖PDS,其糖含量为74.4%、蛋白含量为6.0%。经初步的抗氧化活性评价,表明PDS具有一定的清除DPPH自由基活性。对PDS采用Q Sepherose 4 Fast Flow离子交换层析进行分离得到了五个多糖组分,对其中的三个组分进一步采用Sepharcryl S300凝胶排阻层析分离得到了PDS1、PDS2及PDS3。经Shodex OH pak SB-804柱高效液相色谱分析,证实PDS2及PDS3具有较高的纯度,其重均分子量分别为19.5 kD和44.2 kD。经测定PDS1、PDS2及PDS3的糖含量分别是67.4%、92.6%和49.0%;蛋白含量分别是8.3%、3.8%和8.1%;糖醛酸含量分别是3.6%、7.4%和18.7%;PDS1及PDS3中硫酸基的含量分别是3.1%和7.7%,在PDS2中未检出硫酸基。PDS3具有较为复杂的单糖组成,本论文建立了一种可同时检测11种中性、酸性和碱性单糖的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色谱法,并分别对酸性、中性及碱性单糖的衍生条件进行了优化,确定了混合单糖的最适衍生条件为:反应时间60 min,反应温度70℃,衍生试剂PMP与单糖的最适摩尔比为12:1,加入的碱与单糖最适摩尔比为6:1。在最适衍生及色谱条件下,测定了PDS3的单糖组成为Gal: Man: Ara: Glc: Rha: Xyl: GlcUA: GalUA: GlcNAc: GlcN =19.3: 10.6: 6.9: 1.6: 1.1: 1.0: 12.9: 6.4: 4.1: 1.6。另外,采用糖腈乙酸酯衍生气相色谱法及PMP-HPLC法均发现PDS3中一种未知单糖,推测可能为同一组分。经采用GC-MS分析证实其为一种2-甲氧基戊糖。为了进一步研究PDS3的结构,通过采用降解和层析分离技术获得了具有不同分子量的PDS3片段,结合单糖组成及电喷雾质谱（ESI-MS）分析推测PDS3是一种主链以Man为主,支链以Gal和GalUA为主的多糖,分子中可能含有（Glc）m及（Ara）n（m≥4,n≥3）结构片段。通过采用全水解、高碘酸氧化、Smith降解和甲基化反应等多种化学分析方法,并结合IR、GC-MS分析、核磁共振波谱（NMR）等现代仪器分析方法证实PDS2为α-葡聚糖,主链为-1,4-键型,分子中含有少量的-1,3-及-1,2-键型。本论文确定了盐藻多糖的最适提取条件和分离纯化方法,建立了适合复杂单糖组成分析的柱前衍生高效液相色谱法,并对两种盐藻多糖的结构进行了分析,这些相关研究工作不仅为提取β-胡萝卜素后的盐藻藻渣的综合利用提供了参考,而且为盐藻多糖结构与活性的深入研究提供了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 海藻多糖
• 2 微藻多糖
• 2.1 微藻多糖的活性
• 2.2 微藻多糖的提取、分离及纯化
• 2.3 微藻多糖的结构
• 3 盐藻及盐藻多糖
• 3.1 盐藻概述
• 3.2 盐藻多糖的研究进展
• 4 本论文的立题依据、意义及内容
• 第二章 盐藻多糖的提取和性质研究
• 引言
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 样品的前处理
• 2.2 盐藻粗多糖的提取
• 2.3 多糖的脱蛋白处理
• 2.4 盐藻粗多糖（PDS）的糖含量测定
• 2.5 PDS 的蛋白含量测定
• 2.6 PDS 纯度及分子量范围的测定
• 2.7 PDS 抗氧化活性评价
• 3 实验结果
• 3.1 脱脂溶剂选择
• 3.2 正交试验结果分析
• 3.3 盐藻多糖脱蛋白结果
• 3.3.1 Sevage 法脱蛋白
• 3.3.2 酶法脱蛋白
• 3.3.3 TCA 法脱蛋白
• 3.3.4 阳离子交换树脂脱蛋白
• 3.4 PDS 的糖含量测定结果
• 3.5 PDS 的蛋白含量测定结果
• 3.6 PDS 的纯度及分子量范围
• 3.7 PDS 清除DPPH 自由基活性
• 4 本章小结
• 第三章 盐藻多糖的分离纯化
• 引言
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 PDS 的离子交换分离层析
• 2.2 凝胶柱层析
• 2.3 纯度及分子量范围测定
• 2.4 多糖组分理化性质的测定
• 2.5 薄层色谱（TLC）分析
• 2.6 红外光谱（IR）分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 PDS 的离子交换分离检测结果
• 3.2 凝胶渗透层析
• 3.3 纯度及分子量测定
• 3.4 理化性质测定结果
• 3.4.1 糖含量测定结果
• 3.4.2 蛋白含量测定结果
• 3.4.3 糖醛酸含量测定结果
• 3.4.4 硫酸基含量测定结果
• 3.4.5 TLC 分析
• 3.5 IR 图谱及其解析
• 4 本章小结
• 第四章 盐藻多糖 PD53 的单糖组成及结构初步研究
• 引言
• 1 实验材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 PMP 衍生条件的优化
• 2.2 衍生产物结构的确定
• 2.3 衍生产物稳定性评价
• 2.4 色谱条件的选择
• 2.5 PDS3 的单糖组成测定
• 2.6 PDS3 的结构研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 衍生条件优化结果
• 3.2 衍生产物结构的确定
• 3.3 衍生产物稳定性评价
• 3.4 色谱条件的选择
• 3.4.1 色谱洗脱溶剂的选择
• 3.4.2 流速的选择
• 3.4.3 柱温的选择
• 3.4.4 检测波长的确定
• 3.4.5 精密度和重现性考察
• 3.4.6 线性和检测限的确定
• 3.5 PDS3 的单糖组成测定
• 3.5.1 TLC 分析
• 3.5.2 GC 分析
• 3.5.3 非衍生HPLC 分析
• 3.5.4 PMP-HPLC 法
• 3.6 PDS3 的结构研究
• 3.6.1 PDS3 降解条件的确定
• 3.6.2 PDS3 的水解及分离
• 3.6.3 PDS3 降解片段的单糖组成分析及质谱分析结果
• 4 本章小结
• 第五章 盐藻多糖 PDS2 的结构分析
• 引言
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 单糖组成分析
• 2.2 PDS2 的IR 分析
• 2.3 高碘酸氧化和Smith 降解
• 2.4 甲基化分析
• 2.5 核磁共振（NMR）分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 单糖组成分析
• 3.1.1 PDS2 的TLC 分析
• 3.1.2 PDS2 的GC 分析
• 3.2 PDS2 的IR 分析
• 3.3 高碘酸氧化和Smith 降解结果
• 3.3.1 高碘酸的消耗量与甲酸的生成量
• 3.3.2 酸水解产物分析
• 3.4 PDS2 的GC-MS 分析
• 3.5 核磁共振分析
• 1H-NMR 图谱分析'>3.5.1 PDS2 的¹H-NMR 图谱分析
• 13C-NMR 图谱分析'>3.5.2 PDS2 的¹³C-NMR 图谱分析
• 4 本章小结
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历及参与发表的学术论文