Survivin特异性小发夹RNA真核表达载体的构建及其对HL-60细胞的影响

论文摘要

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由siRNA（small interfering RNA，siRNA）介导的转录后基因沉默。作用机制包括起始阶段和效应阶段，在起始阶段，双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在Dicer酶的作用下，被降解为21～23碱基的siRAN。在效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导活化沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，从而导致mRNA降解，出现转录后的基因沉默。RNAi自1998年被发现以来，国内外学者对其进行了大量的研究工作，证实了RNAi技术不仅基因抑制效果确切，而且有严格的序列特异性，治疗针对性强，副作用小。到目前为止，该技术已在多种恶性肿瘤和白血病细胞的研究中应用，均显示出良好的基因沉默效果。因此，RNAi是目前基因治疗的良好手段。Survivn基因是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptotic protein，IAP）成员之一，位于17q25染色体，基因长度为14.7kb，能编码142个氨基酸组成的分子量约为16.5kD的胞质蛋白。它的BIR结构域可以通过抑制caspase-3和caspase-7而导致细胞凋亡。国内外研究证实，survivin在正常成人组织中不表达，而在恶性肿瘤细胞及白血病细胞中高表达，并且与肿瘤的发生、发展及预后有关。文献报导，应用反义寡核苷酸技术和RNAi技术沉默survivin基因可以导致其他恶性肿瘤细胞凋亡。因此，survivin可能成为白血病基因治疗的一个新靶点。白血病是血液系统的恶性肿瘤，发病率高，恶性度强，严重影响人们的生活质量。20世纪80年代以来，白血病的治疗取得了较大的进展，大剂量化疗、造血干细胞移植及免疫治疗的联合应用，大大提高了白血病患者的生存率。但大剂量化疗具有严重的毒副作用，造血干细胞移植费用昂贵，且具有移植物抗宿主病等并发症，限制了其临床广泛应用。有研究显示以RNA干扰沉默BCR／ABL基因可以促进CML细胞株K562细胞凋亡、抑制其增殖。但以RNA干扰沉默survivin基因对白血病基因治疗的研究报导较少，本研究通过构建Survivin特异性小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）真核表达载体、利用Lipofectamine 2000TM脂质体转染到HL-60细胞。研究survivin基因对白血病细胞的增殖、蛋白表达及凋亡的影响。旨在为以Survivin基因为靶点，RNA干扰为手段的白血病和其他恶性肿瘤的基因治疗的研究提供技术手段和理论基础。方法：（1）构建survivin特异性shRNA真核表达载体，同时构建survivin非特异性真核表达载体。（2）实验分三组：survivin特异性shRNA真核表达载体作用组（转染组）、survivin非特异性真核表达载体作用组（阴性对照组）、未做处理的HL-60细胞组（空白对照组）。（3）用无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，采用脂质体转染法将其转染急性粒细胞白血病细胞株HL-60。（4）用台盼蓝拒染法计数细胞，分别计算转染后24h，48h和72h细胞生长抑制率，观察survivin siRNA对细胞生长增殖的影响。（5）分别在转染后24h、48h、72h收集各组细胞，TRIZOL法提取蛋白，Western-blot方法测定细胞转染后survivin蛋白变化。（6）利用原位酶标记检测法（TUNEL）检测细胞转染后HL-60细胞的凋亡状况。（7）所得数据用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，计数资料采用X2检验。计量资料统计学数据用均数±标准差（（?）±s）表示，多样本均数比较采用方差分析。方差不齐时进行变量转换。检验标准以P＜0.05为有统计学意义。结果：（1）经酶切鉴定和基因测序证实：survivin特异性及非特异性shRNA真核表达载体与设计完全一致，所含目的基因序列准确无误。（2）台盼蓝细胞增殖计数的结果显示：转染survivin特异性小发夹RNA真核表达载体后，转染组细胞生长受到明显抑制，且随作用时间的延长而增强，其转染后24h、48h、72h的生长抑制率分别为17.6±8.5％、38.3±4.2％、44.0±1.2％。转染组与阴性对照组和空白对照组生长抑制率相比，作用24h，48h及72h组均有显著性差异（p＜0.01）。转染组24小时与48小时和72小时相比均有显著性差异（p＜0.01），转染组48h和72h以及空白对照组和阴性对照组各时间段抑制率差异无统计学意义（p＞0.05）。（3） Western-blot结果显示：转染组24h、48h、72h survivin蛋白相对空白对照组表达量分别为0.74±0.01、0.35±0.02、0.34±0.01，阴性对照组分别为0.99±0.02、1.00±0.02、0.99±01，转染组与阴性或空白对照组相比明显降低（P＜0.01）。转染组24h与48h或72h结果相比存在显著性差异（P＜0.01），48h与72h结果相比无显著性差异（P＞0.05）。（4） TUNEL结果：转染48h后，转染组、阴性对照组和空白对照组细胞凋亡率分别为31.0％、3.33％、3.67％，转染组明显高于阴性或空白对照组（P＜0.01）。结论：（1） survivin特异性shRNA真核表达载体构建成功。（2）转染survivin特异性shRNA真核表达载体后，可以使HL-60细胞生长和增殖受到抑制。（3）利用RNA干扰沉默Survivin基因后，可以使HL-60细胞的Survivin蛋白表达量下降，并促进细胞凋亡。（4）转染survivin特异性shRNA真核表达载体后，细胞生长和增殖抑制可能与Survivin蛋白表达量下降及细胞的凋亡增加有关。（5）利用RNA干扰沉默Survivin基因可能是白血病基因治疗的一种有效途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• Survivin特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及其对HL-60细胞的影响
• 前言
• 材料与方法
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述部分 RNA干扰研究现状及其在白血病研究中的应用
• 参考文献
• 英文缩略词
• 致谢